[发明专利]一种猪骨髓内皮祖细胞的分离和培养方法

摘要

本发明属生物细胞技术领域，具体涉及一种小型猪骨髓内皮祖细胞的分离和培养方法。传统的EPCs培养方法较为繁琐，且用免疫磁珠分离会大大降低细胞的获得率。本发明的方法直接用骨髓中单个核细胞进行体外培养以获得EPCs，在培养液中加入生长因子，以一定的密度种植于用纤维连接蛋白包被的培养瓶/皿中或玻璃片上，进行合适培养获得EPC。本发明简化了传统培养方法的步骤，有效的避免传统的分离和培养方法带来的不必要的细胞损失，提高EPCs的获得率，可重复性高，并节省大量的经费。本发明的方法也为今后临床应用做准备，能相应减少骨髓的用量，为自体回输治疗创伤性或缺血性疾病提供合理的技术平台。

主权项

1、一种猪骨髓内皮祖细胞的分离和培养方法，其特征在于该方法依次包括下述步骤：A、取猪髂骨抗凝骨髓5-10ml，用Ficoll密度梯度离心法分离出骨髓中单个核细胞；B、体外培养单个核细胞：先将M-199培养液加入装有细胞的试管混匀后，种于预先包被有纤维连接蛋白的培养瓶/皿中；放入常规细胞培养箱培养2小时后，取出培养皿中的悬浮液，将悬浮液离心，离心条件为4℃，300g，6分钟；离心后去上清液，将添加高浓度血清和生长因子的M-199培养液加入试管后混匀，将混匀的细胞液二次接种于预先包被有纤维连接蛋白的培养瓶/皿中；放入常规细胞培养箱进行培养；每48-96小时给培养皿内的细胞更换为添加低浓度血清和生长因子的M-199培养液一次；培养7天后，所得的贴壁细胞即为EPC；所述的添加高浓度血清和生长因子的M-199培养液的配方为：M-199为基础培养液，20％胎牛血清，重组人EGF 10.0ng/ml，重组bFGF20.0ng/ml，vEGF2.0ng/ml，Long R3 IGF-140.0ng/ml，氢化可的松200ng/ml，抗坏血酸1.0μg/ml，青霉素0.1mg/ml，链霉素0.1mg/ml，两性霉素B 50ng/ml，肝素100U/ml，酚红0.62ng/ml；所述的添加低浓度血清和生长因子的培养液的配方为：M-199为基础培养液，5％胎牛血清，重组人EGF 5.0ng/ml，重组人bFGF 10.0ng/ml，vEGF 0.5ng/ml，Long R3 IGF-120.0ng/ml，氢化可的松200ng/ml，抗坏血酸1.0μg/ml，青霉素0.1mg/ml，链霉素0.1mg/ml，两性霉素B 50ng/ml，肝素100U/ml，酚红0.62ng/ml；C、体外消化传代扩增EPC；D、内皮祖细胞鉴定：进行细胞形态学、表型和细胞功能鉴定。