[发明专利]人血浆DNA中RASSF1A基因甲基化定量检测方法

摘要

本发明涉及一种对人血浆DNA中RASSF1A基因甲基化的定量检测方法。本发明取静脉血后得血浆，制备血浆DNA标准曲线样品，提取待测血浆DNA、标准品血浆DNA和健康人血浆DNA，对血浆DNA、标准品血浆DNA和健康人血浆DNA化学修饰，针对人RASSF1A基因启动子区中565号CpG位点设计特异性引物和Taqman荧光探针荧光定量MSP扩增体系，以标准品血浆DNA的扩增结果制定外标准曲线，对待测样本进行定量结果分析。解决了手术治疗的肿瘤患者病程多数已经处于中晚期，手术标本的获取创伤性大，甲基化的检出率也相对较低等缺陷。具有灵敏度高、最低检出限是1.5×10²拷贝/ml，检测针对RASSF1A基因启动子区中第565号CpG位点，特异性强、获取容易、创伤性小，能够定量检测血浆DNA中RASSF1A基因甲基化。

主权项

1.人血浆DNA中RASSF1A基因甲基化定量检测方法，其步骤在于：(1)取人外周静脉血，EDTA-K2抗凝，离心后取血浆；(2)制备血浆DNA外标准曲线样品；(3)采用磁珠法微量核酸提取技术提取待测血浆DNA、标准品血浆DNA和健康人血浆DNA；(4)采用亚硫酸氢盐法对血浆DNA进行化学修饰，同时修饰标准品血浆DNA和健康人血浆DNA，分别作为阳性和阴性对照；(5)针对人RASSF1A基因启动子区中565号CpG位点设计特异性引物和Taqman荧光探针上游引物序列：RASSF1AMS 5′-GTCGTTGTGGTCGTTCGG-3′，大小为18bp， 分子量为5.94KD；下游引物序列：RASSF1AMA 5′-GAAACTAAACGCGCTCTCG-3′，大小为19bp， 分子量为6.27KD；荧光探针：RASSF1ATP 5′-CCTTACCCTTCCTTCCCTCCTTCGT-3′，大小为25 bp，分子量为8.25KD，5′端标记FAM，3′端标记Eclipse；目的产物大小为95bp，分子量为62.7KD；(6)荧光定量MSP扩增体系/总体积为25μl：H2O 10.3μl，5×Real Time PCR Buffer 5μl，dNTPs/10mM/1.0μl，MgCl2/25mM/2.0μl，上下游引物/5mM/各1.0μl，探针/5mM/0.5μl，热启动酶0.2μl，样本模板投入量为4μl；(7)荧光定量MSP扩增条件：①95℃ 5min；②94℃ 30s，59℃ 30s，72℃ 40s，共55个循环；(8)以标准品血浆DNA的扩增结果制定外标准曲线，对待测样本进行定量结果分析。