[发明专利]H5亚型禽流感病毒核酸检测方法及其试剂盒

摘要

H5亚型禽流感病毒核酸检测方法及其试剂盒，涉及一种病毒。提供一种操作简便、实验可靠性高、可进行实时检测、灵敏度高、特异性好、周期短的H5亚型禽流感病毒核酸检测方法和试剂盒。步骤：1)寻求H5亚型禽流感病毒特有的保守序列作为待测靶基因；2)设计合成一对特异性引物，引物长度为18－30bp；3)根据保守序列设计合成一对Y型双链特异性荧光探针；4)使用步骤2中的一对特异性引物和步骤3中的Y型双链特异性荧光探针及PCR成份组成20μL荧光PCR反应体系的检测溶液，将荧光PCR反应体系的检测溶液装入PCR反应管；5)设置阳性对照模板和阴性对照模板，进行实时荧光PCR反应，获得检测结果。

主权项

1.H5亚型禽流感病毒核酸检测方法，其特征在于包括以下步骤：1)寻求H5亚型禽流感病毒特有的保守序列作为待测靶基因，保守序列为：catt ccacaacata caccctctca ccatcgggga gtgccccaaa tatgtgaaat caaacagattagtccttgcg actggactca gaaatacccc tcaaagagag agaagaagaa aaaagagagg actatttggagctatagcag gttttataga gggaggatgg cagggaatgg tagatggttg；2)设计合成一对H5亚型禽流感病毒特异性引物，引物长度在18～30bp之间，一对H5亚型禽流感病毒特异引物序列为：上游引物：5′-CAT TCC ACA ACA TAC ACC C-3’19bp Tm＝50.7℃，下游引物：5′-CAA CCA TCT ACC ATT CCC T-3’19bp Tm＝51.7℃；3)根据保守序列设计合成一对Y型双链特异性荧光探针，具体要求如下：a.Y型双链特异性荧光探针的长度为18～30bp，退火温度为50～70℃；b.标记荧光剂的链与保守序列完全匹配，另一条链标记淬灭剂；c.两条链的3’端为了防止引发扩增反应需要封闭；d.两条链的一个末端存在碱基完全不匹配，不匹配的碱基长度为2～10bp；4)使用步骤2中的一对特异性引物和步骤3中的Y型双链特异性荧光探针及PCR成份组成20μL荧光PCR反应体系的检测溶液，将荧光PCR反应体系的检测溶液装入PCR反应管，每一PCR反应管中的成份包括1.5～4.0mM MgCl2，0.1～3mM dNTPs，1～3 U Taq酶，0.2～0.5 U反转录酶，上下游引物各为0.2～0.6μM，2μl 10×PCR缓冲液，荧光剂标记探针0.05～0.3μM，粹灭剂标记探针0.06～0.36μM；5)设置阳性对照模板和阴性对照模板，进行实时荧光PCR反应，获得检测结果，阳性对照模板为包含保守序列的MS2噬菌体，阴性对照模板为灭菌后的无离子水，实时荧光PCR反应的条件为42℃反转录15～30min，94℃预变性3～8min后进入循环，循环程序为94℃变性15～30s，51℃退火15～30s，72℃延伸15～30s，共进行35～45个循环，每次循环在退火阶段采集荧光数据。