[发明专利]玉米赤霉烯酮的检测方法

摘要

发明涉及一种玉米赤霉烯酮的检测方法，它是利用玉米赤霉烯酮单克隆抗体制备的免疫亲和柱及荧光光度计来检测玉米赤霉烯酮的方法，属生物细胞学及微生物菌类毒性代谢产物检测方法技术领域。本发明方法的具有以下检测过程和步骤：一.免疫亲和柱的准备和制备：1.制备单克隆抗体：单克隆抗体的制备要通过抗原合成、小鼠免疫、细胞融合、杂交瘤筛选及获取杂交瘤细胞株、采集单克隆抗体等步骤来获得，2.利用上述的单克隆抗体来制备免疫亲和柱；二.样品中玉米赤霉烯酮的分离与检测方法：将玉米试样用甲醇/水溶液提取其中的ZEN，经过过滤步骤并进行适当稀释之后，将液体样品流经亲和柱，再用甲醇洗脱下来后，用荧光分光光度计测定样液中玉米赤霉烯酮的含量。

主权项

1.一种玉米赤霉烯酮的检测方法，它是以单克隆抗体免疫亲和柱为分离装置，用荧光光度计为检测工具的检测方法，该方法的特征是具有以下检测过程和步骤：A.免疫亲和柱的准备和制备：a.制备单克隆抗体，单克隆抗体的制备通过抗原合成、小鼠免疫、细胞融合、杂交瘤筛选及获取杂交瘤细胞株、采集单克隆抗体步骤来获得，其具体步骤为：(a).抗原合成：第一步是玉米赤霉烯酮-羧甲氧肟的制备：称取玉米赤霉烯酮标准品18mg和羰基甲氧胺45mg放置棕小瓶中，加入0.6ml吡啶使之溶解，在室温搅拌24小时后，用真空泵抽干，然后用5ml蒸馏水溶解，用NaOH调PH至9.0，用二氯甲烷4ml连续抽提3次，上层水溶液再用HCL调节PH至2.0，静止5分钟，再用用二氯甲烷4ml连续抽提3次，合并收集3次二氯甲烷液，再用无水硫酸钠脱水，用真空泵将二氯甲烷抽干，残留物即是玉米赤霉烯酮-羧甲氧肟；第二步：玉米赤霉烯酮免疫抗原的制备：称取玉米赤霉烯酮-羧甲氧肟15mg溶解在1ml二氧六环试剂中，加入溶解在1.5ml蒸馏水、PH6.0的BSA(牛血清白蛋白)或OVA(卵白蛋白)约22mg；在1小时内加入180mgEDC(碳二亚胺)，并用HCL维持PH为6.0，室温搅拌24小时，然后再加180mgEDC，不断使溶液维持在PH6.0，继续搅拌48小时左右，用0.01MPBS(PH7.2磷酸缓冲液)充分透析，离心分离后无菌过滤、分装、待用；(b).小鼠免疫：以玉米赤霉烯酮，简称ZEN和牛血清蛋白BSA的偶联复合物，即ZEN-BSA为免疫原免疫小鼠；用60ug抗原ZEN-BSA与50ul弗氏完全佐剂乳化后腹腔注射每只10周龄BALB/C雄性小鼠，一个月后再次免疫，腹腔注射60ug抗原与弗氏不完全佐剂乳化后的抗原，再经过2个月后加强免疫，采用尾静脉注射剂量为60ug抗原，4天后取出小鼠的脾脏细胞，进行下一步的细胞融合；(c).细胞融合：免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞X63-Ag8.653以10∶1混匀，借助50％聚乙二醇进行融合，融合细胞用HAT选择培养基于5％CO2，37℃培养箱中培养；7天后更换HT培养液，第10天进行阳性孔筛选；(d).杂交瘤筛选及获取杂交瘤细胞株：进行阳性孔筛选采用间接非竞争酶联免疫吸附法；将筛选得到的强阳性细胞进行有限稀释克隆化，反复克隆多次，获得多株能稳定分泌抗玉米赤霉烯酮抗体的杂交瘤细胞株，对其中的4E5进行系统鉴定后待用；(e).采集单克隆抗体：将上述4E5杂交瘤细胞株扩大培养后，注入预先注射有降植烷的小鼠腹腔内，使其生长腹水瘤；10天后采集腹水，该腹水中含有大量单克隆抗体；保存好该单克隆抗体备用；b.利用上述的单克隆抗体来制备免疫亲和柱，其步骤如下：(a).称取适量溴化氰活化的琼脂糖干粉，用1mM的稀盐酸使其溶胀，然后在烧结玻璃滤器上冲洗以除去杂质；(b).将溶胀后的琼脂糖凝胶在偶联缓冲液中与上述制备得到的单克隆抗体均匀混合，并在室温下震荡充分反应1小时，偶联缓冲液由0.1M NaHCO3和0.5MNaCL配成，PH值为8.3；(c).除去未与琼脂糖凝胶结合的游离抗体；(d).封闭琼脂糖凝胶珠上残余的活性基团，用0.1MPH值为8.0的Tris-HCl处理偶联复合物，并静置2小时；(e).用含有0..5MNaCl，PH值为4.0的0.1M的乙酸缓冲液淋洗偶联复合物一次，再用含有0.5MNaCl，PH值为8.0的0.1MTris-HCl缓冲液淋洗一次，如此循环反复清洗3次；(f).最后将琼脂糖-抗体复合物填充入55×6mm层析柱中，即制成免疫亲和柱。平衡备用；B.食品和饲料中玉米赤霉烯酮的分离与检测方法称取适量样品，用一定比例的甲醇/水提取其中的ZEN，经过过滤步骤并进行适当稀释之后，将液体样品流经亲和柱达到净化的目的，再用甲醇将亲和柱上的ZEN洗脱下来，在洗脱液中加入氯化铝溶液衍生，提高检测灵敏度，然后用荧光分光光度计测定样液中玉米赤霉烯酮的含量。