[发明专利]成年关中奶山羊皮肤表皮干细胞系的建立

摘要

本发明公开了一种成年关中奶山羊皮肤表皮干细胞系，采用组织块培养法和克隆筛选法，分离纯化关中奶山羊表皮干细胞，并采用无血清培养体系，不需滋养层细胞，实现了关中奶山羊表皮干细胞体外长期扩增，传25代冻存。已冻存2～2.5×10⁸个种子细胞。该类细胞体外倍增时间为28～30小时，细胞直径9～13um之间，测定了其生长曲线和克隆形成率。经免疫组织化学法鉴定表明，所分离的表皮干细胞原代表现为OCt－4阳性，证明其具有与ES细胞类似的分化潜能。传代后的表皮干细胞CK19，integrin－β₁，P63阳性，具有表皮干细胞的典型特性。本发明建立的关中奶山羊表皮干细胞系，是组织工程化皮肤研究的理想实验材料，可用于克隆动物及克隆转基因动物生产。

主权项

1.一种建立成年关中奶山羊皮肤表皮干细胞系的方法，其特征在于：首先采用组织块培养法和克隆筛选法，分离纯化关中奶山羊表皮干细胞；并按以下步骤进行：1)用耳号钳无菌采取3-4岁成年关中奶山羊耳部皮肤块0.5×0.5cm2，置于含青链霉素的生理盐水中；2)在无菌间用PBS(-)反复冲洗去除毛发、血污，在解剖镜下将皮肤与软骨分离；3)将皮肤块切成约0.1×0.2cm2的组织块，按表皮面朝上贴于玻璃或塑料平皿中，加培养基，培养基配方：199+15～20％NBS+5ug/mlinsulin+0.5ug/ml氢化可地松+100u/ml青链霉素；在37℃、5％CO2、饱和湿度的恒温培养箱内培养，每2d换液一次；4)倒置显微镜下观察细胞生长情况：3-4d后，在组织块四周会有上皮样细胞层出现，7d-12d后，在上皮样细胞层上可见有小圆形细胞聚集生长；该类细胞胞体透亮，折光性强，体积小，呈球形，具有干细胞形态学特征；5)待这些克隆增殖到直径为100um～150um时，在解剖镜下将其挑选出来，用0.2％胰酶+0.02％EDTA进行离散或单个细胞，用移胚管将干细胞移入3.5cm塑料皿中，塑料皿中铺有明胶；每皿接种5000-10000个细胞；第二，对上述接种细胞采用无血清培养基培养，3天后换液；此后每二天换液一次；不需滋养层细胞，以实现关中奶山羊表皮干细胞体外长期扩增；待干细胞增殖至75-80％融合时，用0.2％胰酶+0.02％EDTA进行消化传代培养；将关中奶山羊表皮干细胞传至25代，并冷冻大量种子细胞；该类细胞体外倍增时间为28～30小时，细胞直径9～13um之间，并测定其生长曲线和克隆形成率；无血清培养基配方为：F12+1～1.2％BSA+20～25％GSFCM+20～25ng/mlEGF+15～20ng/mlIGF-1+5ug/mlinsulin+0.4～0.5ug/ml氢化可地松+100u/ml青链霉素；第三，经免疫组织化学法鉴定所分离的表皮干细胞原代表现为结合转录因子-4阳，证明其具有与ES细胞类似的分化潜能；传代后的表皮干细胞CK19即角蛋白19，integrin-β1即整合素-β1，P63阳性，具有表皮干细胞的典型特性。