本发明公开了一种冬虫夏草的鉴别及检测方法,其包括以下步骤:(a)从待测样品中提取出核糖体DNA;(b)以步骤(a)中获得的DNA为模板,使用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对和SEQ ID NO.3所示的探针进行实时荧光PCR反应,得到扩增产物;(c)根据扩增产物的荧光的有无和强度来判断是否为冬虫夏草及其含量。本发明另一方面提供包括所述引物对和探针的试剂盒。本发明除了能定性鉴别冬虫夏草的真伪外,还能检测样品中冬虫夏草的含量,其检测限量可低至0.0001ng/μl,比现有技术更加灵敏,并且本发明能有效检测冬虫夏草加工后核酸降解严重的样品,检测结果比现有技术更加准确有效。