本发明提供一种恒温条件下检测猴痘病毒的引物组及冻干试剂盒,引物组包括猴痘病毒的上游外引物、猴痘病毒的下游外引物、猴痘病毒的上游内引物以及猴痘病毒的下游内引物。所述猴痘病毒的上游外引物具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列;所述猴痘病毒的下游外引物具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列;所述猴痘病毒的上游内引物具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列;所述猴痘病毒的下游内引物具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。在有效地对猴痘病毒进行检测,确保准确性、特异性和敏感性高、重复性好的同时,能够在恒温条件下检测,20min内完成检测获得结果。