本发明公开一种敲除人HMGB1基因的细胞株及其应用,属于分子生物学领域。本发明提供一种靶向敲除人HMGB1基因的gRNA序列,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。利用CRISPR‑Cas9技术首次在人Huh7细胞基因组上敲除HMGB1基因,使得HMGB1蛋白的表达完全丧失,获得HMGB1敲除的Huh7细胞株,且敲除细胞株形态、生长速度等方面均与对照细胞无明显差异,是较为理想的HMGB1敲除的细胞模型;且操作简便,周期短,成本低,改造后细胞株稳定,可用于研究HMGB1蛋白在自噬、凋亡、细胞炎症、病毒感染等方面的具体作用机制。本发明获得的细胞株能够显著增强乙型脑炎病毒毒株的感染。