本发明涉及生物检测技术领域,具体公开了用于鉴别检测非洲猪瘟I177L基因缺失株的引物探针组合、试剂盒与方法。本发明用于鉴别非洲猪瘟I177L基因缺失株的双重荧光定量PCR的引物探针组合,其含有两对特异性引物和两条特异性探针,其中,所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.1‑2和SEQ ID NO.13‑14所示,所述特异性探针的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.15所示。该引物和探针组合可实现对I177L基因缺失的新型非洲猪瘟减毒活疫苗的特异性检测。本发明同时提供用于鉴别非洲猪瘟病毒和I177L基因缺失株双重荧光PCR检测试剂盒,其操作简便、特异性强、敏感性高、重复性好,可实现定性和定量检测。