本发明涉及生物工程技术领域,尤其涉及一种人巨细胞病毒gBt抗原及其制备方法和应用。人巨细胞病毒gBt抗原具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列;或具有经SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经替换、缺失或增加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。人巨细胞病毒糖蛋白gB是该病毒参与感染过程的关键蛋白,本发明截取gB糖蛋白全长氨基酸序列中121‑640范围内的氨基酸片段作为gBt抗原氨基酸序列,构建重组质粒表达载体gBt,并对其进行蛋白表达、纯化及验证。本发明制备的gBt抗原可用于人巨细胞病毒抗体的检测,为临床上人巨细胞病毒抗原诊断和抗体研发奠定了基础。