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[发明专利]一种采用高酵母菌生产4-胆甾烯-3-酮的制备工艺-CN201811500852.1在审
发明人：王友富;王荣;王炳乾;王洪福;邵振平;雷灵芝;黄橙橙;王瑞;陈克纲;应杨波 -专利权人： 浙江神洲药业有限公司
申请日： 2018-12-10 - 公布日： 2019-07-05 - 主分类号： C12N15/01 文献下载
摘要：本发明涉及微生物酶工程技术领域，具体公开了一种采用高酵母菌生产4‑胆甾烯‑3‑酮的制备工艺，包括以下步骤：采用从土壤中自主分离出来的酵母菌为出发菌株，通过紫外线光照诱变处理，获得胆固醇氧化酶高产突变株为产生菌株；将产生菌株放入斜面培养基中，在25‑30℃的温度下，培养40‑45h；将培养后的菌种放入种子培养基中，在25‑30℃的温度下，培养8‑12h，得到种子液；将种子液加入自动发酵罐中，与自动发酵罐中的发酵液混合均匀，在转速为300‑450r/min的旋转摇床上培养20‑25h，培养温度为25‑30℃。该采用高酵母菌生产4‑胆甾烯‑3‑酮的制备工艺，简化了高酵母菌生产4‑胆甾烯‑3‑酮的制备工艺流程，而且提高了胆固醇氧化酶的产率。
酵母菌胆甾制备工艺胆固醇氧化酶产生菌株种子液放入生产高产突变株酶工程技术斜面培养基种子培养基紫外线光照自动发酵罐出发菌株旋转摇床诱变处理工艺流程发酵液产率菌种制备微生物发酵土壤

[发明专利]一种新的新金色分枝杆菌表达体系的构建方法-CN201811528696.X在审
发明人：王友富;王荣;王炳乾;王洪福;邵振平;雷灵芝;黄橙橙;王瑞;陈克纲;应杨波 -专利权人： 浙江神洲药业有限公司
申请日： 2018-12-14 - 公布日： 2019-07-05 - 主分类号： C12N15/74 文献下载
摘要：本发明涉及新金色分支杆菌技术领域，且公开了一种新的新金色分枝杆菌表达体系，由克隆载体转染宿主构成，克隆载体在启动子3’端接有碱基序列，该克隆载体从6’至4’依次构建克隆载体的克隆位点，包括以下可操作性元件：耶普拉茨286骨架质粒、Exogenous source基因表达盒、Screening markers基因表达盒；耶普拉茨286质粒是酵母附加体质粒，SD序列后连接有目的基因，Exogenous source基因表达盒自上方至下方依次含有核糖DNA启动子、IRES核酸序列、Exogenous source基因表达框、rDNA终止子；Screening markers基因表达盒包括启动子、Screening markers基因、终止子，克隆载体插入克隆位点中。该新的新金色分枝杆菌表达体系的构建方法，具备能够在无诱导条件下对新金色分支杆菌进行表达的优点。
克隆载体基因表达盒金色分枝杆菌表达体系构建金色分支杆菌克隆位点启动子终止子宿主基因表达框骨架质粒核酸序列碱基序列目的基因诱导条件核糖质粒转染酵母体质基因

[发明专利]一种在双降醇中分枝杆菌甾酮C1;2位脱氧酶基因敲除的方法-CN201811539294.X在审
发明人：王友富;王荣;王炳乾;王洪福;邵振平;雷灵芝;黄橙橙;王瑞;陈克纲;应杨波 -专利权人： 浙江神洲药业有限公司
申请日： 2018-12-17 - 公布日： 2019-07-05 - 主分类号： C12N15/74 文献下载
摘要：本发明涉及基因敲除技术领域，具体公开了一种在双降醇中分枝杆菌甾酮C1,2位脱氧酶基因敲除的方法，该方法具体为首先对结核分枝杆菌、鸟结核分枝杆菌、耻垢分枝杆菌的甾酮C1,2位脱氢酶基因序列进行比对,根据保守区的同源序列设计引物，以分枝杆菌染色体DNA为模板，A1和B1为引物，通过聚合酶链式反应扩增目的基因，将聚合酶链式反应产物及质粒PUC‑18。该在双降醇中分枝杆菌甾酮C1，2位脱氧酶基因敲除的方法，能够充分对分支杆菌中的C1,2位脱氢酶进行敲除。
分枝杆菌敲除甾酮酶基因脱氧聚合酶链式反应产物聚合酶链式反应鸟结核分枝杆菌脱氢酶基因序列耻垢分枝杆菌结核分枝杆菌染色体DNA 分支杆菌基因敲除目的基因设计引物同源序列保守区脱氢酶比对扩增引物质粒

[发明专利]一种制备双降醇的工艺-CN201811546481.0在审
发明人：王友富;王荣;王炳乾;王洪福;邵振平;雷灵芝;黄橙橙;王瑞;陈克纲;应杨波 -专利权人： 浙江神洲药业有限公司
申请日： 2018-12-18 - 公布日： 2019-07-05 - 主分类号： C12P33/00 文献下载
摘要：本发明涉及双降醇制备技术领域，且公开了一种制备双降醇的工艺，包括选取适量的放线菌中的分枝杆菌活体菌种进行多重诱变制备C1，2脱氢酶以及C22脱氢酶双重缺陷菌株，将C1，2脱氢酶以及C22脱氢酶双重缺陷菌株放入发酵培养基中，将适量的发酵液注入玻璃瓶中，并对发酵液进行搅拌和水浴加热，提取适量的稀硫酸，将稀硫酸中和至pH3～3.5，加入3‑6ml的珍珠岩助滤剂，加热搅拌1～2h，加入聚合氯化铝和聚丙烯酰胺，持续搅拌2～3h，停止加热，排出热水，用冷水浴降至45～50℃。该制备双降醇的工艺，通过C1，2脱氢酶以及C22脱氢酶双重缺陷菌株能够快速有效的制备双降醇，且制备的双降醇纯化和精制度高，便于人们使用。
脱氢酶制备双重缺陷菌株发酵液稀硫酸珍珠岩助滤剂制备技术领域发酵培养基聚丙烯酰胺聚合氯化铝持续搅拌分枝杆菌活体菌种加热搅拌水浴加热停止加热玻璃瓶放线菌精制度冷水浴放入排出诱变中和

[发明专利]一种采用金色分枝杆菌制备孕烯醇酮的方法-CN201811551991.7在审
发明人：王友富;王荣;王炳乾;王洪福;邵振平;雷灵芝;黄橙橙;王瑞;陈克纲;应杨波 -专利权人： 浙江神洲药业有限公司
申请日： 2018-12-19 - 公布日： 2019-07-05 - 主分类号： C12P33/00 文献下载
摘要：本发明涉及孕烯醇酮制备技术领域，公开了一种采用金色分枝杆菌制备孕烯醇酮的方法，步骤为，S1：取保存好的金色分支杆菌接种在PDA平板上，30℃下培养3d，待金色分支杆菌长满平板后，将无菌Tritonx‑1000.1％5mL注入平板，轻摇使金色分支杆菌孢子均匀分散取，将悬浮液接种于沙仕固体培养基中，于30℃恒温培养36h；S2：将步骤S1中培养36h后的金色分支杆菌平板置于无菌紫外灯下照射处理，照射强度为285.8W/c㎡，照射时间为5‑15min，然后将处理过的平板在光照下30℃培养36h，取出样本；S3：将步骤S2中培养后的产生样本放入培养基中，在30℃的温度下，培养45h。该采用金色分枝杆菌制备孕烯醇酮的方法，能够解决目前生产方法效率低，成本较高，不能满足生产需求的问题。
金色分支杆菌孕烯醇酮金色分枝杆菌制备无菌接种样本照射制备技术领域固体培养基恒温培养生产需求照射处理培养基悬浮液紫外灯放入孢子光照取出保存生产

[发明专利]一种利用基因工程菌制备孕烯醇酮的方法-CN201811560587.6在审
发明人：王友富;王荣;王炳乾;王洪福;邵振平;雷灵芝;黄橙橙;王瑞;陈克纲;应杨波 -专利权人： 浙江神洲药业有限公司
申请日： 2018-12-20 - 公布日： 2019-07-05 - 主分类号： C12P33/00 文献下载
摘要：本发明涉及基因工程技术领域，且公开了一种利用基因工程菌制备孕烯醇酮的方法，包括以下步骤：S1：首先选择噬菌粒载体，并对其进行去核处理，将全基因合成的生物酶基因片段孕烯醇酮克隆到高效表达载体中，构建了产孕烯醇酮的基因工程载体，通过紫外线光照诱变处理，获得孕烯醇酮氧化酶高产载体；S2：将步骤S1中所得到的产生载体放入培养基中，在10‑20℃的温度下，培养40‑45h；S3：将步骤S2中培养后的载体加入到50ml二颈瓶中，在室温搅拌下加入浓度为85％的NaHCO3溶液，反应3.5h，再加热至100℃，并搅拌。该利用基因工程菌制备孕烯醇酮的方法，解决了现有的生产方法效率低，不能满足生产需求的问题。
孕烯醇酮基因工程菌制备高效表达载体基因工程技术基因工程载体全基因合成噬菌粒载体紫外线光照基因片段生产需求室温搅拌诱变处理培养基生物酶氧化酶再加热放入构建颈瓶去核克隆高产生产

[发明专利]一种氧化酶在水解植物甾醇的提纯方法-CN201811569031.3在审
发明人：王友富;王荣;王炳乾;王洪福;邵振平;雷灵芝;黄橙橙;王瑞;陈克纲;应杨波 -专利权人： 浙江神洲药业有限公司
申请日： 2018-12-21 - 公布日： 2019-07-05 - 主分类号： C12P33/00 文献下载
摘要：本发明公开了一种氧化酶在水解植物甾醇的提纯方法，它涉及植物甾醇技术领域；它包括如下步骤：水解：将植物油移入水解釜内，加入硫酸、磺酸和水，然后回流1‑4小时；脱臭馏出物：将水解的植物油进行脱臭馏出物，脱臭馏出物发生甲酯化反应，真空脱水，然后将甘油三酯水解成脂肪酸和甘油；加入甲酯化试剂后，分离甾醇，收集滤液；酶催化酯化；脱溶；真空蒸馏；甾醇和V_E；分离；废物造粒；本发明能实现在酯化前进行水解，提高提纯效率，其提纯率能达到99.3‑99.8％，与现有工艺相对比能节省1‑3小时；便于有效的保护环境，再提纯后能实现废物造粒，回收废物，不易造成污染；同时在生产时废水较少，有利于生产。
提纯水解脱臭馏出物甾醇植物油水解植物氧化酶造粒酯化废物甲酯化反应甲酯化试剂脂肪酸甘油三酯回收废物提纯效率真空脱水真空蒸馏植物甾醇酶催化水解釜甘油磺酸脱溶移入硫酸废水生产污染

[发明专利]一种偶发分枝杆菌及其在转化植物甾醇中的应用-CN201811461542.3在审
发明人：王友富;王荣;王炳乾;王洪福;邵振平;雷灵芝;黄橙橙;王瑞;陈克纲;应杨波 -专利权人： 浙江神洲药业有限公司
申请日： 2018-12-02 - 公布日： 2019-04-09 - 主分类号： C12N1/20 文献下载
摘要：本发明公开了一种偶发分枝杆菌及其在转化植物甾醇中的应用，此种偶发分枝杆菌能够有效的催化植物甾醇生成9α‑羟基雄烯二酮，转化率超过95％，选择性高达50％～60％，利用此种偶发分枝杆菌株生产9α‑羟基雄烯二酮的单耗在2.2～2.5，主要产物为9α‑羟基雄烯二酮，制备步骤简洁，转化效率高，具有较好的应用前景。
偶发分枝杆菌雄烯二酮羟基转化植物甾醇应用植物甾醇转化效率催化制备生产

[发明专利]一种黄体酮晶型及其制备方法-CN201710344823.X在审
发明人：王友富;王荣;王炳乾;邵振平;雷灵芝;黄橙橙;王瑞;陈克纲;应杨波 -专利权人： 浙江神洲药业有限公司
申请日： 2017-05-16 - 公布日： 2017-12-01 - 主分类号： C07J7/00 文献下载
摘要：本发明公开了一种黄体酮的晶型，该晶型的粒径为0.01‑500um，粉末的X‑射线衍射图在衍射角2θ＝17.0±0.2°处有特征峰。该晶型是通过将黄体酮溶解于有机溶剂中得到溶液，该溶液在搅拌下常压浓缩或减压浓缩，残留物在‑10℃‑30℃下搅拌结晶，过滤、60℃‑120℃真空干燥、粉碎的方法制备获得的。本发明获得的晶型具有良好的收率和稳定性，可有效的提高生物利用度，该晶型适宜多种制剂，如黄体酮片、黄体酮胶囊，且制备方法简单，稳定性高。
一种黄体酮及其制备方法

[发明专利]一种螺内酯晶型及其制备方法-CN201710344774.X在审
发明人：王友富;王荣;王炳乾;邵振平;雷灵芝;黄橙橙;王瑞;陈克纲;应杨波 -专利权人： 浙江神洲药业有限公司
申请日： 2017-05-16 - 公布日： 2017-12-01 - 主分类号： C07J21/00 文献下载
摘要：本发明公开了一种螺内酯晶型，该晶型的粒径为0.01‑500um，粉末的X‑射线衍射图在衍射角2θ＝17.3±0.2°处有特征峰。该晶型是通过将螺内酯溶解于有机溶剂中得到溶液，该溶液在搅拌下常压浓缩或减压浓缩，残留物在‑10℃‑30℃下搅拌结晶，过滤、80℃‑130℃真空干燥、粉碎的方法制备获得的。本发明获得的晶型具有良好的收率和稳定性，可有效的提高生物利用度，该晶型适宜多种制剂，如螺内酯片、螺内酯胶囊，且制备方法简单，稳定性高。
一种内酯及其制备方法

[发明专利]一种制备黄体酮的方法-CN201710344822.5在审
发明人：王友富;王荣;王炳乾;邵振平;雷灵芝;黄橙橙;王瑞;陈克纲;应杨波 -专利权人： 浙江神洲药业有限公司
申请日： 2017-05-16 - 公布日： 2017-07-07 - 主分类号： C07J7/00 文献下载
摘要：本发明公开了一种制备黄体酮的全新工艺路线，该路线采用了更加便宜易得的起始原料4‑雄烯二酮(4AD)，各步反应独立性较好，线路简洁，操作简便，适合工业化生产，并且产率好，5步累计产率在55％以上，甚至达到60％。在目前传统原料双烯醇酮醋酸酯呈现价格飞涨的局面下，该工艺路线的成功，将具有极高的生产应用及经济价值，更为重要的是，本方法避免了使用传统方法中的剧毒试剂——丙酮氰醇，既经济又环保，有利于工业化生产。
一种制备黄体酮方法

[发明专利]一种螺内酯中间体睾丸素内酯的合成方法-CN201410458784.2有效
发明人：王荣 -专利权人： 浙江神洲药业有限公司
申请日： 2014-09-11 - 公布日： 2017-01-11 - 主分类号： C07J21/00 文献下载
摘要：本发明涉及化学药物的合成方法，具体是一种螺内酯中间体睾丸素内酯的合成方法，该方法以化合物I 4‑雄烯二酮(4AD)为原料，经过加成脱硅醚和氧化环合两步反应，得到化合物III睾丸素内酯，反应路线如下：受市场供求关系的影响，本发明以更加便宜易得的4‑雄烯二酮(4AD，I)为起始原料，在目前传统原料——双烯醇酮醋酸酯呈现价格飞涨的局面下，该工艺路线的成功，将具有极高的生产应用及经济价值。
一种内酯中间体睾丸素合成方法

[发明专利]一种螺内酯中间体坎利酮的合成方法-CN201410460505.6有效
发明人：王荣 -专利权人： 浙江神洲药业有限公司
申请日： 2014-09-11 - 公布日： 2015-02-04 - 主分类号： C07J21/00 文献下载
摘要：本发明涉及一种化学药物的合成方法，具体是一种螺内酯中间体坎利酮的合成方法。该方法以化合物I 4-雄烯二酮(4AD)为原料，依次经过炔化反应、氢化反应、氧化环合反应、上溴脱溴反应制得化合物V坎利酮，反应路线如下：本发明对于重要的21,17-羧内酯螺环结构的构建，采取了与以前工艺不同的方式，开发了一条更简洁高效的合成路线，本发明具有收率高、选择性好、成本低、反应温和、能够适合工业化的特点，该方法稳定，易于实现。
一种内酯中间体坎利酮合成方法

[发明专利]一种制备黄体酮的方法-CN201310539601.5有效
发明人：王友富 -专利权人： 浙江神洲药业有限公司
申请日： 2013-11-04 - 公布日： 2014-01-22 - 主分类号： C07J7/00 文献下载
摘要：本发明涉及一种制备黄体酮的方法，该方法以4-雄烯二酮（4AD）为原料，依次经过羟氰化、脱水、保护、氢化、加成水解反应制得黄体酮。该方法使用了更具价格优势的原料4-雄烯二酮，且反应条件易于控制，后处理简单，收率较高。
一种制备黄体酮方法

[发明专利]一种坎利酮衍生物类甾体化合物、其制备方法及其在制备依普利酮中的用途-CN201110350636.5有效
发明人：李援朝;张斌;王友富;王均良;陈红莉;冯慧瑾 -专利权人：中国科学院上海药物研究所;浙江神洲药业有限公司
申请日： 2011-11-08 - 公布日： 2013-05-08 - 主分类号： C07J21/00 文献下载
摘要：本发明涉及一种坎利酮衍生物类甾体化合物，其制备方法和其在医药领域中的用途，具体而言，涉及7α-硝基甲基-11α，17β-二羟基-3-氧代-17α-孕甾-4-烯-21-羧酸-γ-内酯(式2所示的化合物)、其制备方法以及其在制备依普利酮中的用途。本发明的关键步骤在于以硝基甲烷作为亲核试剂，立体选择性在C-7位引入α-硝基甲基，从而进一步构建依普利酮C-7α位构型的羧酸甲酯结构，具有步骤简短，条件温和，成本低廉的特点。
一种坎利酮衍生物类化合物制备方法及其依普利酮中的用途