提供了一种慢病毒表达载体及其构建方法与应用,所述慢病毒表达载体的质粒骨架以PLVX‑Puro为基础,通过如下步骤改造完成:a.在5'LTR上游通过基因合成和亚克隆的方式加入CMV增强子和启动子;b.将原来的5'LTR更换成长度为181bps的新5'LTR(SEQ ID NO:3);c.将原来载体上的CMV启动子更换成EFS启动子;d.将原来载体多克隆位点后面的PGK启动子删除,同时引入P2A连接子序列;e.将原来的Puro抗性更换成更短的Blasticidin抗性;f.将原来的3'LTR更换成部分删除U3的LTR(SEQ IDNO:7)。改造获得的慢病毒表达载体相比于PLVX‑Puro具有更高的包装容量。