本发明涉及一种针对腺病毒载体的单域重链抗体及其应用。所述单域重链抗体的VHH包括框架区FR和互补决定区CDR,单域重链抗体的VHH的氨基酸序列包括SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列,其核苷酸序列包括SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列。该单域重链抗体、及其核酸、载体及宿主细胞可用于检测腺病毒载体试剂、腺病毒治疗性抗体药物、以及腺病毒载体疫苗等的纯化和制备。该单域重链抗体能够在大肠杆菌中高效表达,特异识别腺病毒载体,具有特异性好等优点,为研发腺病毒治疗性抗体病药物和检测试剂方面提供广阔的应用前景。