本发明公开了一种实时荧光PCR检测鸟分枝杆菌的方法及其应用。本发明提供了特异引物对,建立基于SYBR Green I荧光染料的检测MA的实时荧光PCR方法。该发明灵敏度高、特异性好、重复性好,相对于DNA芯片技术、PCR‑指纹图谱等方法价格更低廉、操作更简便;与目前菌种鉴定的“金标准”相比,检测MA无显著性差异,为临床鉴定MA提供简单、廉价、准确性高的分子生物学方法。该发明提高了缺乏经验的实验技术人员的工作效率,减少实验操作难度,降低出错机率,使其培训后即可开展实验。与其他分子生物学方法相比,在具有较高诊断准确性的情况下,降低成本,减少实验经费,更易于在临床中推广。