本发明公开了一种检测耐药基因的引物组合物及其应用,包含引物A和引物B,其中引物A选自引物对1~2,引物B选自引物对3~5;所述引物对1为核苷酸序列如SEQ IDNO.1~2所示的引物;所述引物对2为核苷酸序列如SEQ ID NO.3~4所示的引物;所述引物对3为核苷酸序列如SEQ ID NO.5~6所示的引物;所述引物对4为核苷酸序列如SEQ ID NO.7~8所示的引物;所述引物对5为核苷酸序列如SEQ ID NO.9~10所示的引物。本发明提供的引物特异性强,灵敏度高,用于检测的操作流程简单,成本低廉,同时能够大批量、快速且精确地从核酸含量低的环境样本中检测出多重耐药基因,大大节约了检测的时间和成本,可推广用于抗生素污染的监测。