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[发明专利]刺参体腔细胞吞噬活性的流式细胞检测方法-CN201110062287.7无效
发明人：刘洪展;郑风荣;屈佩;孙修勤 -专利权人：山东大学威海分校
申请日： 2011-03-08 - 公布日： 2011-12-14 - 主分类号： G01N15/14 文献下载
摘要：本发明公开了一种刺参体腔细胞吞噬活性的流式细胞检测方法，属于海洋生物技术领域，首先分离、制备刺参体腔液中的吞噬细胞，然后用荧光素异硫氰酸酯FITC标记热灭活后的酵母细胞，再将标记后的酵母细胞与刺参吞噬细胞共孵育，最后利用流式细胞仪测定吞噬活性。本发明准确性高、重复性好，而且操作简便快速，为探讨刺参体腔细胞吞噬功能提供了方法依据。
刺参体腔细胞吞噬活性检测方法

[发明专利]一种刺参拮抗菌及其应用-CN201110079359.9无效
发明人：郑风荣;刘洪展;曲凌云;吴艳君;孙修勤;刘均玲 -专利权人：国家海洋局第一海洋研究所
申请日： 2011-03-31 - 公布日： 2011-10-05 - 主分类号： C12N1/20 文献下载
摘要：本发明涉及一种刺参拮抗菌及其应用，所述的刺参拮抗菌为奥氏弧菌，其保藏编号为CGMCC No.4668。本发明的拮抗菌用于制备菌液制剂和提取胞外产物。本发明筛选的具有拮抗刺参皮肤溃烂、围口部肿胀疾病活性的细菌，拮抗活性强，利用盐析法制备的拮抗菌胞外产物的产量稳定，成本低，可具有较高的拮抗活性。使用该拮抗菌或拮抗产物对刺参的免疫保护率达70-80％，使用该拮抗菌产物为纯生物制剂，且具有安全、环保的特点，不会产生药物残留和环境造成污染，并且该方法可从根本上遏制刺参皮肤溃烂、围口部肿胀疾病的发生和流行。
一种刺参拮抗及其应用

[发明专利]一种大菱鲆致病菌株及腹水病灭活疫苗-CN201110026657.1无效
发明人：郑风荣;刘洪展;殷树淼;孙修勤;张进兴 -专利权人：国家海洋局第一海洋研究所
申请日： 2011-01-25 - 公布日： 2011-08-17 - 主分类号： C12N1/20 文献下载
摘要：本发明筛选出了一种大菱鲆的致病菌株，为鲁氏不动杆菌，保藏编号为CCTCC NO:M2010372。将筛选出的鲁氏不动杆菌去制备灭活疫苗。另外，鲁氏不动杆菌和河豚毒素假交替单胞菌、假单胞菌来制备二联或三联灭活疫苗，用来对大菱鲆腹水病进行免疫。本发明制备的大菱鲆腹水病灭活疫苗的制备工艺简单、产量稳定，成本低，可大量获得具有较高免疫效果的灭活疫苗。使用该方法制备的灭活疫苗的免疫保护率达70％，该疫苗为纯生物制剂，且具有安全、环保的特点，不会产生药物残留和环境造成污染，并且该方法可从根本上遏制大菱鲆腹水病的发生和流行，为大规模制备大菱鲆新型腹水病灭活疫苗提供了技术支持。
一种大菱鲆致病菌株腹水病灭活疫苗

[发明专利]一种中度嗜盐的无机解磷功能菌-CN201010546338.9有效
发明人：曲凌云;孙修勤;朱凤玲;洪旭光;张进兴 -专利权人：国家海洋局第一海洋研究所
申请日： 2010-11-17 - 公布日： 2011-05-11 - 主分类号： C12N1/20 文献下载
摘要：本发明涉及保藏号为CGMCC No.4212的一种中度嗜盐的无机解磷功能菌YH8，本发明属微生物技术领域。目前我国滨海盐土种植中缺乏有效的无机解磷菌。本发明涉及的菌株分离自海底沉积物，其能在pH值为4-9、NaCl浓度为0.5-15％(w/v)的环境中生长。本发明涉及的菌株具有溶解磷酸钙的能力，实验室培养结果表明该细菌能使初始pH值为7.8，可溶性磷浓度为0的含磷酸钙的培养基中最终可溶性磷浓度达到280mg/l，pH值降至5。本发明提供的无机解磷菌菌株YH8由于有较广的pH值和NaCl生长适应范围，可适应滨海盐土生存环境，并能明显降低培养环境的pH值，这使本发明十分有意义。
一种中度无机功能

[发明专利]牙鲆淋巴囊肿病基因工程疫苗及其生产方法-CN201010141352.0无效
发明人： 孙修勤;郑风荣;吴谡琦;吴兴安;沈志强;曲凌云;张进兴;洪旭光;郑明刚 -专利权人：国家海洋局第一海洋研究所
申请日： 2010-04-06 - 公布日： 2011-01-26 - 主分类号： A61K48/00 文献下载
摘要：一种牙鲆淋巴囊肿病基因工程疫苗及其生产方法，其特征是该基因工程疫苗由大小为0.6kb的淋巴囊肿病毒核衣壳蛋白基因MCP片段，插入到真核表达载体pEGFP-N2中构成的重组质粒pEGFP-N2-LCDV-MCP 0.6kb。将其转化入大肠杆菌制备生产用菌种，划线到Mi nca琼脂平板、分离纯化、制备并确定合格的一级种子，再接种于琼脂扁瓶中，在37℃培养后24-48h后，对其鉴定确定合格的二级种子；再发酵培养得到发酵的二级种子培养菌液；进行菌体收集、离心、质粒DNA提取、纯化，进行常规检验合格者即得。本发明完整的生产工艺简便、稳定性好和成本低；比目前的灭活疫苗、减毒疫苗、多肽疫苗、亚单位疫苗和重组多肽疫苗等免疫效果好、安全无副作用。
淋巴囊肿基因工程疫苗及其生产方法

[发明专利]一种刺参球形病毒的分离方法-CN201010273964.5无效
发明人：郑风荣;刘洪展;孙修勤;张进兴;李继业 -专利权人：国家海洋局第一海洋研究所
申请日： 2010-09-04 - 公布日： 2011-01-19 - 主分类号： C12N7/00 文献下载
摘要：本发明涉及一种刺参球形病毒的分离方法。其特征在于包括刺参球形病毒粗提液的制备和高纯度的刺参球形病毒溶液制备两个步骤：刺参球形病毒粗提液的制备步骤是将携带刺参球形病毒的组织低温下研磨，用含抗生素的灭菌过滤海水冲洗后差速离心制得粗提液；高纯度的刺参球形病毒溶液制备步骤是将制得的粗提液用密度梯度离心方法分离得到病毒沉淀，将沉淀用TNE或PBS缓冲液溶解后制得高纯度的刺参球形病毒溶液。本发明的方法将差速和密度梯度离心结合了起来，并尽量减小污染和无菌操作。本发明的特点是过程简单、成本低，可大量获得刺参球形病毒材料，以满足刺参疾病的早期诊断、预防和治疗的病毒材料的需求。
一种刺参球形病毒分离方法

[发明专利]牙鲆淋巴囊肿病的多肽疫苗的制备方法-CN200510104312.8无效
发明人：吴谡琦;孙修勤;张进兴;郑凤荣;洪旭光;曲凌云 -专利权人：国家海洋局第一海洋研究所
申请日： 2005-10-18 - 公布日： 2006-06-14 - 主分类号： A61K38/12 文献下载
摘要：一种牙鲆淋巴囊肿病的多肽疫苗的制备方法，首先对已知的淋巴囊肿病毒欧洲分离株基因组序列所进行的生物信息学分析而得到牙鲆淋巴囊肿病毒中国分离株核衣壳蛋白和囊膜蛋白的3个模拟表位，然后依据模拟表位的氨基酸序列，合成得到相应的3种多肽，经过与蛋白质载体的偶联与纯化，即制备了牙鲆淋巴囊肿病的模拟表位多肽疫苗。本方法制备简便、疫苗能够有效诱导产生全面的细胞和体液免疫应答，还具有很高的安全性。上述的3个模拟表位序列分别为：TKNNMSRTSETDN、CKKNSDSTD和TNEERRLMGT。采用的蛋白质载体为钥孔槭血蓝蛋白，也可采用血红蛋白、小牛血清白蛋白等。
淋巴囊肿多肽疫苗制备方法

[发明专利]病原微生物模拟表位的生物信息学筛选方法-CN200510018067.9无效
发明人：吴谡琦;孙修勤;张进兴;郑凤荣;洪旭光;曲凌云 -专利权人：国家海洋局第一海洋研究所
申请日： 2005-09-30 - 公布日： 2006-05-17 - 主分类号： C12Q1/68 文献下载
摘要：一种病原微生物模拟表位的生物信息学筛选方法。本方法首先对LCDV－1基因组序列进行了BLAST比对，从中筛选得到保护性抗原蛋白候选基因TK和ORF29；然后分别对两个基因表达的蛋白质进行了疏水和亲水性、抗原性和跨膜结构分析，综合12种结构性质分析结果，最后通过综合性抗原指数的计算公式(I)，其中，将I＞O的序列推定未知的LCDV－cn相应的模拟表位。再将上述获得的模拟表位进行人工合成，通过竞争性酶联免疫吸附分析检验各种模拟表位的免疫反应性。本发明充分利用丰富的核酸和蛋白质序列资源，通过特定的生物信息学分析方法快速捕获未知病源微生物抗原蛋白的模拟表位。
病原微生物模拟生物信息学筛选方法

[发明专利]鳗弧菌减毒活疫苗-CN03151159.7无效
发明人：马悦;张元兴;邵明非;孙修勤;何建国;叶巧真;黄志坚;刘允坤 -专利权人：华东理工大学
申请日： 2003-09-24 - 公布日： 2005-03-30 - 主分类号： A61K39/02 文献下载
摘要：本发明提供了一种鳗弧菌减毒活疫苗及其制备方法。相对于其野生毒株具有明显的低毒性和免疫保护率，可有效地防护敏感鱼种免受强弧菌病致病力鳗弧菌野生株的侵染。
弧菌减毒活疫苗

[发明专利]扇贝血淋巴细胞中热休克蛋白70的流式细胞术检测方法-CN200410035591.2无效
发明人：曲凌云;孙修勤;相建海 -专利权人：国家海洋局第一海洋研究所
申请日： 2004-08-20 - 公布日： 2005-03-23 - 主分类号： G01N33/536 文献下载
摘要：一种扇贝血淋巴细胞中热休克蛋白70的流式细胞术检测方法，首先抽取与抗凝剂等量的扇贝血淋巴液，离心后用生物缓冲液洗涤细胞，再次离心并用细胞固定剂进行固定；然后将固定的细胞分成两份——阳性处理样和阴性本底对照，阳性处理样用间接荧光染色法对热休克蛋白70进行荧光标记，阴性本底对照只进行异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠IgG的孵育；最后用流式细胞仪对上述阳性处理样和阴性本底对照进行荧光强度的测量，两者荧光强度的比值即为热休克蛋白70的相对表达量。因此本发明提供了一种操作简便、灵敏度高，可准确反映应激状态下热休克蛋白70表达的活体检测法。本发明作为活体检测，还可应用于其它包括淡水贝类，从而反映环境污染状态。
扇贝淋巴细胞休克蛋白 70 细胞检测方法

[发明专利]一种鱼类病毒的检测试剂盒及其检测方法-CN200310114693.9无效
发明人： 孙修勤;李继业;张进兴;洪旭光;吴谡琦;曲凌云 -专利权人：国家海洋局第一海洋研究所
申请日： 2003-12-31 - 公布日： 2004-12-22 - 主分类号： G01N33/569 文献下载
摘要：一种鱼类病毒的检测试剂盒及其检测方法，盒体上面有布设内盛溶液的、多种瓶体的圆孔，盒体底面延伸舌上可置放备用的附件，如杂交膜、袋等，14只瓶内有洗液，缓冲液各3种，对照液、显色液各2种以及封闭液、抗体液、探针液、研磨液各一种。方法是先取待测鱼组织，在研磨液C中充分研磨；然后取其上清液，待变性后点样于一张杂交膜上；该膜在交联和预杂交后，与变性后的探针液K进行杂交反应；然后分别用洗液D和B清洗，再与抗体液L进行免疫反应；再经洗液A洗后，与显色液NBT/BCIP进行显色反应，最后检查并记录杂交膜上的显色结果。点样处出现蓝色斑点的相对应的鱼组织，则已被病毒感染。可早期方便地检测出病毒感染的精、卵、亲鱼、鱼苗及成鱼，以免造成重大损失。
一种鱼类病毒检测试剂盒及其方法

[发明专利]海水鱼淋巴囊肿病毒的纯化方法-CN01107824.3无效
发明人： 孙修勤;曲凌云;张进兴 -专利权人：国家海洋局第一海洋研究所
申请日： 2001-02-23 - 公布日： 2003-12-31 - 主分类号： C12N7/02 文献下载
摘要：本发明涉及一种海水鱼淋巴囊肿病毒的纯化方法。它是采用微孔滤膜过滤法和蔗糖密度梯度离心法相结合的方法，并考虑到尽量减小污染和保证无菌操作条件制成。本发明的特点是可以获得高纯度和高得率的淋巴囊肿病毒，以满足制备疫苗或作为病毒基因学、致病基因筛选和克隆技术使用的病毒。
海水淋巴囊肿病毒纯化方法

[发明专利]海水鱼二联弧菌灭活疫苗的制备方法-CN00129465.2无效
发明人： 孙修勤;张进兴;曲凌云 -专利权人：国家海洋局第一海洋研究所
申请日： 2000-12-29 - 公布日： 2002-07-31 - 主分类号： A61K39/106 文献下载
摘要：本发明涉及一种海水鱼二联弧菌灭活疫苗的制备方法。它是从病鱼体内分离出鳗弧菌和付溶血弧菌并在一定条件下进行分别培养,再以生物反应器扩大培养并进行灭活处理、等量混合后得到相应的二联灭活疫苗。现场可进行投喂或浸泡免疫,其制作和投予方便安全且免疫效果好,能有效防治鱼类的皮肤溃疡、眼球混浊及由该二种病原引起的其它疾病。可广泛用于海水鱼养殖中。
海水二联弧菌疫苗制备方法

[发明专利]对虾饵料及制作方法-CN89102897.8无效
发明人： 孙修勤;王云鹏;张进兴;孙占新;卢颖 -专利权人：国家海洋局第一海洋研究所;唐海县沿海开发公司
申请日： 1989-04-26 - 公布日： 1991-09-11 - 主分类号： A23K1/18 文献下载
摘要：本发明涉及一种新的对虾药物饵料及其制作方法。该药物饵料是在基础饵料中添加中、西药物配制而成。通过对虾摄食药饵，增强虾群对疾病的抵抗能力和耐低氧能力，促进对虾生长发育，提高养殖产量。该药物饵料已在大水体进行试验，取得明显效果，具有推广应用的价值。
对虾饵料制作方法

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