本发明公开一种能够稳定表达截短型EBNA1蛋白的重组CHOK1细胞株的构建方法,包括以下步骤(1)EBNA1t表达载体的构建,将如SEQ ID NO1所示序列克隆至pWX1.0和pWX2.0载体中;(2)转染与细胞群筛选;(3)有限稀释法克隆,挑选单克隆细胞株。本发明还公开上述方法获得的重组CHOK1‑EBNA1t细胞株用于重组蛋白瞬时表达的应用,包括以下步骤(1)构建重组蛋白瞬时表达载体;(2)转染前进行细胞传代培养;(3)转染与细胞培养工艺,使用PEI将步骤(1)得到的重组蛋白瞬时表达载体转染步骤(2)传代培养获得的CHOK1‑EBNA1t细胞株;(4)评估重组蛋白的表达量。本发明的重组CHOK1‑EBNA1t细胞株用于重组蛋白瞬时表达,不仅表达量高,一般为100‑300mg/L,而且工艺简便,既适用于大体积生产,也适用于小体积高通量筛选。