本发明提供一种基于刺糖多孢菌内源CRISPR‑Cas系统编辑载体的构建及其应用。本发明第一方面提供一种基于刺糖多孢菌内源CRISPR‑Cas系统构建的核酸分子,包括Repeat序列和crRNA序列,所述Repeat序列位于所述crRNA序列的上游和下游,其中:Repeat序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;crRNA序列靶向刺糖多孢菌基因组中PAM序列的下游序列,可由反向互补的两条引物退火合成,所述PAM序列包括TCA、TCG、CCA、CCG中的一种。本发明可敲除刺糖多孢菌基因组的目标基因,为刺糖多孢菌的功能基因组研究、代谢工程及合成生物学改造育种提供了有力的遗传操作工具。