本发明公开了一种检测传染性脾肾坏死病毒的引物组、试剂盒及其方法和应用。本发明的检测传染性脾肾坏死病毒的引物组,包括:上游引物F1和下游引物R;其中,所述上游引物F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;所述下游引物R选自R1、R2、R3中的任一种,该引物组能够特异性识别传染性脾肾坏死病毒的ORF70L基因序列。此外,本发明的检测传染性脾肾坏死病毒的方法具备速度快、特异性强、能够现场检测、不需要大型设备、检测成本低的优点,可以在采样的现场进行快速检测,手机拍摄成像结果传送至云端处理后在手机生成检测结果。