本发明公开了一种DNA条形码,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。DNA条形码首次公开了圆叶葡萄的ITS序列,为圆叶葡萄的物种鉴定提供了有效的分子标记;另外DNA条形码还包括部分保守序列,在应用于葡萄的物种鉴定时具有通用性。本发明公开了制备上述DNA条形码的核苷酸序列的方法及引物,能够用于获得圆叶葡萄ITS区的序列。本发明还公开了圆叶葡萄的分子鉴定方法、用于鉴定圆叶葡萄的检测引物和试剂盒,利用检测引物或试剂盒进行PCR扩增获得葡萄ITS2区序列,然后将扩增序列与圆叶葡萄的DNA条形码序列进行比对或应用于构建葡萄的系统发育树,实现对葡萄品种的精准鉴定,且鉴定过程操作简单、效率高,重复性好。