本发明涉及一种抗Ep‑cam蛋白单克隆抗体,所述单克隆抗体的重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。发明人还提供了一种抗Ep‑cam蛋白单克隆抗体的制备方法,选取Ep‑cam蛋白第24位至第265位氨基酸片段并在其C末端添加6个His作为免疫原并进行蛋白重组,所述重组蛋白经由大肠杆菌重组表达。发明人再提供了一株分泌抗Ep‑cam蛋白的杂交瘤细胞系,所述细胞系为小鼠杂交瘤细胞系4B5E6D7,保藏号为:CGMCC NO.17406。所述的抗Ep‑cam蛋白单克隆抗体适用于免疫检测,膜定位准确、特异性强、敏感性强。