本发明公开了一种DNA聚合酶突变体及其制备方法和应用。所述DNA聚合酶突变体的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列。本发明中,利用分子进化技术对来源于Thermococcuslitoralis的TliDNA聚合酶进行遗传改造,能够提高酶活性,使其更加适用于难度序列的扩增,保真性高,如在扩增ITR结构时,条带单一,且扩增下来的序列几乎没有缺失或突变,扩增高GC或有复杂结构的片段时,条带单一,回收浓度高;在PCR扩增时,延伸时间短,延伸速度可达1sec/kb,对长片段的扩增效率高,具有广阔的应用前景。