本发明公开了一种基于人源TLR4基因的多功能双荧光素酶报告基因载体及其构建方法与应用,属于分子遗传学领域。本发明多功能双荧光素酶报告基因载体为pGLTlr4/‑3494+235/3UTR,载体的DNA序列如SEQ ID NO.5所示;多功能双荧光素酶报告基因载体包含人源TLR4基因‑3494至+235序列和完整3'‑UTR序列,人源TLR4基因‑3494至+235序列如SEQ ID NO:1所示,完整3'‑UTR序列如SEQ ID NO:2所示;人源TLR4基因‑3494至+235序列和3'‑UTR完整序列分别克隆于pGL3‑Basic质粒中萤火虫荧光素酶luc基因的上游和下游。本发明将TLR4基因上下游非编码序列分别无缝克隆至萤火虫荧光素酶luc基因的上下游,使得载体的结构组成比传统荧光素酶报告质粒更加接近体内真实情况,有效避免外源启动子对实验结果的负面影响。