本发明提供了一种用于检测病毒性心肌炎相关病毒的多重荧光定量PCR的试剂盒。其中,该试剂盒包括DNA病毒引物探针混合液和RNA病毒引物探针混合液;其中,DNA病毒引物探针混合液中的引物包括SEQ ID NO:1等序列;DNA病毒引物探针混合液中的探针包括连接有第一荧光基团和第一淬灭基团的SEQ ID NO:3等序列;RNA病毒引物探针混合液中的引物包括SEQ ID NO:10等序列;RNA病毒引物探针混合液中的探针包括连接有第二荧光基团和第二淬灭基团的SEQ ID NO:12等序列。能够解决现有技术中病毒性心肌炎相关检测时间长的问题,适用于生物技术领域。