本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种高效羟化4‑雄烯‑3‑酮系列化合物9α位的羟化酶及其应用,所述羟化酶氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示,所述羟化酶能够生产9α‑羟基‑4‑雄烯‑3‑酮类化合物。本发明的C9α羟化酶KshA底物识别宽泛,高产9α‑羟基‑4‑雄烯‑3‑酮类化合物,纯化过程不受还原组分KshB共表达的限制,可用于体外产生9α‑羟基‑4‑雄烯‑3‑酮类化合物,本发明还提供了一株生产9α‑羟基‑4‑雄烯‑3,17‑二酮的工程菌,其可转化20g/L植物甾醇产生9.8g/L的9α‑羟基‑4‑雄烯‑3,17‑二酮。