本发明公开了一种用于检测辣椒斑驳病毒的引物组合物及其应用、由其组成的试剂盒及试剂盒的应用,其中引物组合物包括外引物和内引物,外引物包括外引物F3和外引物B3,外引物F3的DNA序列为SEQ ID NO.1所述的DNA序列,外引物B3的DNA序列为SEQ ID NO.2所述的DNA序列;内引物包括内引物FIP和内引物BIP,内引物FIP的DNA序列为SEQ ID NO.3所述的DNA序列,内引物BIP的DNA序列为SEQ ID NO.4所述的DNA序列。该引物组合物和由其组成的试剂盒可应用于辣椒斑驳病毒的快速诊断和鉴别,具有检测灵敏度高、特异性好、操作简便快捷等优势。