本发明公开了一种非洲猪瘟病毒p72N抗原表位蛋白及其制备方法和用途。所述的p72N抗原表位蛋白选自p72N1~p72N11抗原表位蛋白中的任意一种或是由p72N1~p72N11抗原表位蛋白中任意两种以上串联后得到的多表位蛋白,所述的p72N1~p72N11抗原表位蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1~11所示。本发明以我国分离的ASFVpig/HLJ/2018毒株的主要结构蛋白p72N为对象,利用生物信息学技术结合免疫学方法,预测、筛选ASFV的抗原表位,绘制这些蛋白的抗原表位图谱,最终确定了11个抗原表位(肽)为非洲猪瘟病毒p72N蛋白的抗原表位。这些候选抗原表位的获得,极大了节省了传统抗原表位筛选的成本和时间,提高了免疫学方法验证具有良好免疫保护功能的抗原表位的效率,对研发ASF新型疫苗和检测技术具有十分重要的意义。