本发明涉及分子生物学技术领域,具体涉及mir124和HER2‑shRNA双基因表达盒病毒载体、构建方法、病毒、应用。该双基因表达盒病毒载体包括在病毒表达载体中整合连接mir‑124序列和HER2‑shRNA序列构建而成;其中mir‑124序列如SEQ ID NO.1所示,HER2‑shRNA序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。对乳腺癌细胞转染率高达80%~90%,在乳腺癌细胞中能够高效稳定地表达mir‑124和HER2‑shRNA,发挥协同增效作用,能够显著的抑制乳腺癌细胞的增殖并促进凋亡,可用于乳腺癌、卵巢癌等HER2阳性肿瘤的基因治疗。