本发明属于分子遗传学技术领域,公开了一种猪Zfy基因的RNA干扰片段、表达载体及其应用,猪Zfy基因的RNA干扰片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。本发明的猪Zfy基因的RNA干扰片段,能够对猪Zfy基因的表达进行人为干扰,使Y精子的生成和发育受阻,为X精子创造更多的受精机会,从而使子一代的母仔比例增加,达到控制后代仔猪性别的目的,且对精子细胞不会造成损伤也不会降低其活力。本发明在受精前有效控制了后代性别,达到了控制后代猪性别的目的,而且成本低廉。本发明提供的RNA干扰片段对猪Zfy基因有较好的沉默效应,干扰Zfy基因后,后代仔猪中母仔率为66.46%。