一种非洲猪瘟病毒点亮RNA探针检测试剂盒及其制备方法和应用,属于食品生物技术领域。包括一种非洲猪瘟病毒点亮RNA探针,核苷酸序列如SEQ ID NO.1。该探针与非洲猪瘟病毒核酸序列p54的部分特异序列特异结合,核苷酸序列如SEQ ID NO.2。一种非洲猪瘟病毒点亮RNA探针检测试剂盒,包括检测滤纸片、p54部分特异序列SEQ‑p54和DEPC‑水溶液。非洲猪瘟病毒点亮RNA探针检测试剂盒在非洲猪瘟病毒检测上的应用。本发明点亮RNA探针亲和性强,和待测样品中的p54 RNA特异性结合,产生荧光。整个检测过程耗时短,成本低,能够在离体无活细胞和无活病毒的体系中对非洲猪瘟实现快速安全的检测。