本发明适用于生物技术领域,提供了一种检测生物制品中SV40核酸的引物组、试剂盒及方法,该试剂盒包括荧光标记探针和引物组;其中,引物组包括:正向引物,其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示;以及反向引物,其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示;荧光标记探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示。本发明实施例通过上述引物组和荧光标记探针,可以用于准确、灵敏地定量检测抗体和疫苗等生物制品中SV40核酸的残留量,从而可以准确地评估生物制品中残余SV40核酸的风险,其在生物制品残余杂质质量控制方面具有广泛的用途。