本发明公开了一种用于指示DNA分子量大小的电泳条带清晰的DNA Marker及其制备工艺,属于生物技术领域。本发明据载体SEQ No.1设计一条上游引物,扩增长度分别为100bp,250bp,500bp,750bp,1000bp,1500bp,2000bp的7条下游引物,以载体SEQ No.1为模板对目的DNA片段进行PCR扩增,测定扩增产物含量并进行DNA片段配方优化,得到含有7个DNA片段100bp,250bp,500bp,750bp,1000bp,1500bp,2000bp的DL2000 DNA Marker。本发明公开的DL2000 DNA Marker与市售DL2000 DNA Marker相比,多设计了一条1500bp的条带,且该方法适宜于根据自身需要制备含有能扩增到的不同大小片段的DNA Marker。