本发明公开了一种大刺鳅性别鉴定的特异性DNA片段、遗传性别标记引物及应用;特异性DNA片段分别为下列之一:Contig‑1上游引物,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;Contig‑1下游引物,其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;Contig‑2上游引物,其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;Contig‑2下游引物,其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;大刺鳅性别鉴定的遗传性别标记引物,其为引物对1,包括Contig‑1上游引物和Contig‑1下游引物。将该特异性DNA片段及遗传性别标记引物应用于大刺鳅全雄性育种。本发明适用范围广、耗时短,检测结果准确。