[发明专利]一种可促进成骨分化的天然超分子水凝胶材料的制备方法

权利要求书

1.一种可促进成骨分化的天然超分子水凝胶材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1) 制备AC-β-环糊精：通过丙烯酰氯改性β-环糊精，使酰氯与β-环糊精上的羟基反应成功制得AC-β-环糊精；

(2) 制备AC-阿仑膦酸钠：利用N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺改性阿仑膦酸钠，形成带双键的AC-阿仑膦酸钠；

(3) 将明胶、步骤（1）制得的AC-β-环糊精与步骤（2）制得的AC-阿仑膦酸钠溶解于杜氏磷酸盐缓冲溶液中，再将CaCl₂、MgCl₂和2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮溶解于杜氏磷酸盐缓冲溶液中，两种溶液混合经过紫外光照射从而形成GCA水凝胶；

(4) 将人体间充质干细胞平铺在步骤（3）制得的GCA水凝胶表面，水凝胶环境中生长4天后，进行骨髓间充质干细胞活/死细胞染色法检测细胞活性；

(5) 或者将人体间充质干细胞包覆在步骤（3）制得的GCA水凝胶内部，水凝胶环境中生长21天后，进行骨髓间充质干细胞茜素红染色检测细胞矿化和对成骨表达因子进行检测。

2.根据权利要求1所述的一种可促进成骨分化的天然超分子水凝胶材料的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述的AC-β-环糊精制备方法为：先将10g β-环糊精溶于150mL DMF，将溶液冰浴降温，加入三乙胺7.2mL，滴加5-10mL丙烯酰氯0.5 h -1.5h，反应过夜，随后将反应的溶液旋转蒸发浓缩到5-10mL，在400-500mL丙酮中沉淀，抽滤并用丙酮洗涤沉淀，真空干燥形成最终的AC-β-环糊精产物。

3.根据权利要求1所述的一种可促进成骨分化的天然超分子水凝胶材料的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述的AC-阿仑膦酸钠制备方法为：将1.4g阿仑膦酸钠溶于400mLTEOA缓冲溶液中，用5M NaOH调节PH至8，反应1-2天，随后将反应的溶液旋转蒸发浓缩，在400-500mL冰乙醇中沉淀，抽滤并用乙醇洗涤沉淀，真空干燥形成最终的AC-阿仑膦酸钠产物。

4.根据权利要求1所述的一种可促进成骨分化的天然超分子水凝胶材料的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述的GCA水凝胶的形成，制备方法如下：首先配置含有16wt%明胶、7wt% AC-β-环糊精和100M 阿仑膦酸钠的杜氏磷酸盐缓冲混合溶液1；再配置100M CaCl₂、MgCl₂，其中Ca：Mg质量比=5:3和0.5wt% 2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮的杜氏磷酸盐缓冲混合溶液2；将混合溶液2加入到混合溶液1中，均匀混合，并且用20w紫外灯照射10min后形成GCA水凝胶。

5.根据权利要求1所述的一种可促进成骨分化的天然超分子水凝胶材料的制备方法，其特征在于，步骤（4）所述的骨髓间充质干细胞活/死细胞染色法检测细胞活性，其检测方法如下：步骤（3）中的方法制备的GCA水凝胶支架先用75wt%酒精浸泡30min灭菌，在紫外光照射下照射2h，然后以2×104细胞/孔的密度将细胞接种在样品上培养；放置于37℃下的CO₂培养箱中进行培养；培养1和4天后，使用活/死细胞染色法检测水凝胶上的细胞增殖情况；用倒置荧光显微镜观察活/死细胞状态。

6.根据权利要求1所述的一种可促进成骨分化的天然超分子水凝胶材料的制备方法，其特征在于，步骤（5）所述的骨髓间充质干细胞茜素红染色检测细胞矿化和对成骨表达因子进行检测，其检测方法如下：根据步骤（3）中的方法准备材料并对水凝胶前体溶液进行消毒后对人体间充质干细胞分别进行包覆后成胶；包覆后的四组GCA支架材料首先置于37℃下孵育4h，随后放入CO2培养箱中进行体外培养；21天后将样品取出并使用茜素红试剂盒子测定细胞中磷酸钙的形成用于判定矿化；进一步对I型胶原蛋白（COL-I）、骨钙素（OCN）基因和Runt相关转录因子（Runx-2）的基因表达情况进行测试。