[发明专利]一种简便、快捷的星形胶质细胞分化方法

说明书

本发明属于干细胞定向分化技术领域，具体涉及一种星形胶质细胞分化方法。一种简便、快捷的星形胶质细胞分化方法，包括：制备海藻酸盐凝胶基底；在所述海藻酸盐凝胶基底上铺蛋白；将神经干细胞制备成细胞悬液，接种至凝胶基底，培养12小时以上；更换为诱导培养基，每隔24小时换液一次，继续培养三天可获得星形胶质细胞。本发明的方法，缩短干细胞分化周期，提高了星形胶质细胞的分化纯度与效率，更好的为相关研究提供细胞资源。

技术领域

本发明属于干细胞定向分化技术领域，具体涉及一种星形胶质细胞分化方法。

背景技术

星形胶质细胞是中枢神经系统的多功能胶质细胞，参与构成大脑的物理结构，具有支持神经细胞、维持神经元周围离子浓度、免疫调节等重要作用。星形胶质细胞在大脑发育过程中发挥活跃功能，是感觉和认知能力发展的关键。星形胶质细胞可由神经干细胞经诱导分化而来，以神经干细胞的诱导分化作为细胞的来源方式已成为一系列中枢神经系统疾病治疗的一个重要关注点。

目前，由神经干细胞向星形胶质细胞方向的分化方法相对空白且单一，单纯通过添加胎牛血清（FBS）或骨形态发生蛋白4（BMP4）诱导神经干细胞分化获得星形胶质细胞的方法存在分化效率低、产物不纯等问题。由于神经类细胞更适宜生长于柔软基底，现有培养条件的塑料或玻璃培养皿，质地坚硬，对其生长分化可能存在限制。相反，水凝胶材料因其交联网络的存在，具有类似软组织的特性，可为神经类细胞的生长提供较柔软基底。但是基质凝胶（Matrigel）等动物源基底存在价格昂贵、可能引入动物源材料污染以及宗教信仰限制等局限性。因此，需要提出一种基于其他水凝胶材料的、提高星形胶质细胞分化效率的方法。

发明内容

鉴于此，本发明构建了一种基于海藻酸盐凝胶基底的、针对神经干细胞向星形胶质细胞方向的细胞分化平台，具有基底材料价廉易得、生物相容性好，可简便、快捷获得纯度高且分化效果佳的星形胶质等优点。在解决了海藻酸盐凝胶形状不易控制问题的基础上，将其引入到细胞培养体系中，为细胞培养分化提供一个力学可调的基底，其力学调控可来源于刚度、粘弹性等因素，实现神经干细胞向星形胶质细胞的高效分化。

本发明采用的技术方案是：一种简便、快捷的星形胶质细胞分化方法，包括：

制备海藻酸盐凝胶基底；

在所述海藻酸盐凝胶基底上铺蛋白；

将神经干细胞制备成细胞悬液，接种至凝胶基底，培养12小时以上；

更换为诱导培养基，每隔24小时换液一次，继续培养三天可获得星形胶质细胞。

进一步地，海藻酸盐凝胶基底的制备方法包括：

制备浓度为2%（w/v）的海藻酸钠溶液，过滤除菌备用，制备交联液，过滤除菌备用；

于培养皿中加入海藻酸钠溶液，置于-80℃冷冻定型10分钟；于室温加入交联液交联2.5小时，凝胶形成后通过紫外光照射除菌；其中，按培养皿底面积计，海藻酸钠溶液、交联液的体积分别为：45μL/cm²、260μL/cm²。

进一步地，所述的交联液为90 mM的氯化钙和150 mM氯化钠的混合溶液。

进一步地，用含有钙镁离子的PBS溶液配制浓度为10-20μg/ml的层粘连蛋白溶液，加入海藻酸盐凝胶基底表面，于细胞培养箱中过夜；按培养皿底面积计，层粘连蛋白溶液的添加量为：130μL/cm²。

进一步地，接种密度按培养皿底面积计：10000-30000/cm²。

进一步地，所述的诱导培养基为从常规培养液中去除表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子，加入5%胎牛血清的培养基。

与现有方法相比，本发明的主要优点包括：

1.缩短干细胞分化周期，提高了星形胶质细胞的分化纯度与效率，更好的为相关研究提供细胞资源。