[发明专利]一种农杆菌介导转化生菜组织培养方法

说明书

本发明提供了一种农杆菌介导转化生菜组织培养方法，属于农杆菌介导植物组织培养技术领域。本发明包括用农杆菌菌液侵染生菜无菌苗的外植体，将侵染后的生菜外植体相继置于愈伤‑发芽培养基、生根培养基上进行诱导，驯化移栽；所述愈伤‑发芽培养基组成为：蔗糖25.0‑35.0g/L+琼脂7.0‑8.0g/L+IAA 1.0‑1.5mg/L+6‑BA 0.5‑0.9mg/L。本发明通过特定的愈伤‑发芽培养基，省略了共培养过程且不必添加抗生素，缩短了组培周期，保证了生菜组织培养过程中高发芽率、高生根率、低污染率和低褐化率。

技术领域

本发明属于农杆菌介导植物组织培养技术领域，尤其涉及一种农杆菌介导转化生菜组织培养方法。

背景技术

生菜(Lactuca sativa.L.)属菊科莴苣属莴苣种中的叶用类型，是叶用莴苣的俗称，为一、二年生草本植物。生菜极富营养，含有抗氧化物、胡萝卜素及维生素B₁、B₂、B₆和V_C、V_E，它还含有丰富的微量元素，如钙、磷、钾、钠、镁及少量的铜、铁、锌，此外，还含有膳食纤维素，茎叶的乳状汁液还含有大量的有机物，如糖、有机酸、蛋白质、苦苣素等。

生物技术在生菜育种中得到广泛应用，其中，在生菜上的转基因方法有农杆菌介导法和电激法等，其中农杆菌介导法为主要的方法。稳定的植物组织和细胞培养再生系统是利用农杆菌介导转化法进行植物转基因的重要前提。在现有的农杆菌介导生菜组织培养体系中，常经过无菌苗培养、农杆菌侵染、暗环境共培养2-3天、诱导愈伤组织培养、诱导发芽培养、生根培养、移栽过程。如CN106794570A公开了一种农杆菌介导生菜遗传转化培养基体系，将生菜子叶放到共培养培养基中在28℃黑暗培养2天，再进行诱导愈伤组织、诱导发芽、生根培养；罗淑萍等(2005年)公开了一种根癌农杆菌介导的叶用莴苣基因转化系统的建立，同样将不定芽在28℃黑暗条件下培养3 天，再进行不定芽培养。现有研究通常认为被感染的受体材料在用抗生素筛选除菌前与根癌农杆菌进行共培养是根癌农杆菌T-DNA转化和整合到植物染色体的关键时期，其共培养的时间长短则直接影响到目的基因的整合及转化细胞的数量，从而影响遗传转化率。然而，共培养时间过短，T-DNA转移过程不能完成；延长共培养时间，农杆菌在培养基及受体材料表面会过分生长，又不利于植物外植体的存活和随后抗性愈伤组织筛选时对根癌农杆菌的抑制。

此外，采用农杆菌介导转化法，在培养过程中必须在筛选培养基添加抗生素以抑制农杆菌生长，但不同的抗生素对植物转化效率也有影响。用于抑制根癌农杆菌生长的抗生素如羧苄青霉素、头孢霉素等会对某些植物的转化效率及外植体的生长和分化产生影响。如羧苄青霉素可刺激愈伤组织的增殖，而头孢霉素则对杂种杨的愈伤组织形成有明显的抑制作用。

因此，现有的农杆菌介导的生菜组织培养过程受到的影响因素较多，如共培养时间、共培养条件、抗生素的选择与用量等，不易人工调控，容易对组织培养过程产生负面影响，且培养周期过长，不利于育种工作的进行。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种农杆菌介导转化生菜组织培养方法，直接利用特定愈伤-发芽培养基对侵染生菜外植体进行培养，省略了共培养过程，缩短生菜组织培养周期，且无需添加抗生素，提升愈伤组织诱导发芽率，减少褐化率。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种农杆菌介导转化生菜组织培养方法，用农杆菌菌液侵染生菜无菌苗的外植体，将侵染后的生菜外植体相继置于愈伤-发芽培养基、生根培养基上进行诱导，驯化移栽；所述愈伤-发芽培养基组成为：蔗糖25.0-35.0g/L+ 琼脂7.0-8.0g/L+IAA 1.0-1.5mg/L+6-BA 0.5-0.9mg/L。

优选的是，所述生菜无菌苗苗龄为5-8天。

优选的是，所述生菜外植体为叶片。