[发明专利]用于测试拉喹莫德在治疗缺血性脑卒中的作用的方法

权利要求书

1.一种用于测试拉喹莫德在治疗缺血性脑卒中的作用的方法，其特征在于：具体方法如下：

(1)先建立急性缺血性脑卒中小鼠模型

1)选用成年野生型雄性ICR小鼠,周龄为6-8周，重量约为25±2g，在温度25±2℃、湿度70±5％和光照12h:黑暗12h循环情况下，于无病原体饲养中心培养小鼠；

2)采用光化学栓塞法制作小鼠脑缺血模型，共设Sham组、IS3d组、IS5d组、IS 3d+LQ-25mg/kg组、IS 3d+LQ-50mg/kg组、IS 5d+LQ-25mg/kg组、IS 5d+LQ-50mg/kg组7组；

3)按随机数表法，将70只周龄为8周的ICR小鼠进行分组，除Sham组外，其余各组小鼠腹腔注射浓度为10mg/ml的玫瑰红100mg/kg，5分钟后，腹腔再注射浓度为5％的水合氯醛200mg/kg，麻醉后，对小鼠进行缺血手术，小鼠脑立体定位于S1FL区；

4)缺血手术结束后30分钟，向IS3d+LQ-25mg/kg组、IS 3d+LQ-50mg/kg组、IS5d+LQ-25mg/kg组以及IS 5d+LQ-50mg/kg组小鼠灌胃Laquinimod-L12699；

5)术后密切观察各组小鼠生命体征，造模完毕后将小鼠置于37℃热板复苏，待苏醒后将其置于鼠笼饲养；

(2)进行行为学试验和冰冻切片

行为学试验包括圆筒试验和网格爬行试验，使用以上2种行为学试验测定小鼠各阶段的运动功能，以评估Sham组，IS组和LQ给药组的运动功能相关指标；

冰冻切片可用于尼氏染色和TUNEL细胞凋亡试剂盒染色，观察小鼠病灶区尼氏染色的图像和TUNEL细胞凋亡免疫染色的图像。

2.根据权利要求1所述的用于测试拉喹莫德在治疗缺血性脑卒中的作用的方法，其特征在于：所述圆筒试验用于评估小鼠上肢协调性的情况，观察小鼠在直立状态下使用上肢的偏好，可以通过评估损伤侧肢体的使用频率和意愿反应小鼠的恢复情况，具体步骤如下：

1)试验在安静的环境下进行，选取小鼠最活跃的时间段晚上7:00-10:00进行；

2)小鼠被放置在圆筒状的透明有机玻璃里一共3min，全程录像，圆筒后面设置玻璃以获取小鼠背对摄像机的情形；

3)每次小鼠直立状态下双上肢接触圆筒壁然后又放回地面记为一组。

3.根据权利要求1所述的用于测试拉喹莫德在治疗缺血性脑卒中的作用的方法，其特征在于：所述网格爬行试验用来评估小鼠运动的协调性，具体步骤如下：

1)试验在安静的环境下进行，选取小鼠最活跃的时间段晚上7:00-10:00进行；

2)小鼠被放置在圆柱形的铁丝网内，其直径和高为27.5cm x 22cm，铁丝网的网格为边长是1cm的正方形，铁丝网被固定在实验室工作台上，一共1min，全程录像；

3)拍摄小鼠所有的运动，记录小鼠的步行错误。

4.根据权利要求1所述的用于测试拉喹莫德在治疗缺血性脑卒中的作用的方法，其特征在于：所述冰冻切片的具体步骤如下：

1)用5％水合氯醛分别麻醉各组小鼠，先用1×PBS溶液心脏灌注，再用4％PFA溶液灌注，将灌注后的脑组织浸入4％PFA中24h；

2)组织脱水：将组织换入30％的蔗糖溶液，待组织沉下即完成脱水；

3)取出脑组织用OCT包埋后于-80℃冰箱放置10min；

4)使用冰冻切片机切片，每张组织厚度为30um,得到的冰冻切片可直接进行下一步染色或于组织冻存液保存。