[发明专利]一种PEG修饰鸢尾素类似物及制备方法

说明书

本发明公开了一种PEG修饰鸢尾素类似物及制备方法，属于生物技术领域。一种PEG修饰鸢尾素类似物的结构式为：所述鸢尾素类似物是将鸢尾素59位的半胱氨酸突变成丝氨酸，其氨基酸序列见SEQ ID NO1。该类似物具有长效性。本发明的制备方法包括如下步骤：1)鸢尾素类似物质粒的构建，2)重组质粒的转化，3)工程菌种的发酵，4)包涵体溶解，5)阴离子柱纯化，6)透析复性及酶切，7)Ni柱纯化，8)PEG修饰，9)修饰样品反相纯化。本发明解决了鸢尾素在复性过程中出现错误二聚体以及在体内稳定性差的问题。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种PEG修饰蛋白类似物及制备方法，特别的是一种PEG修饰鸢尾素类似物及制备方法。

背景技术

鸢尾素(Irisin)是Bostrom等于2012年发现的一个新型调节因子。有研究表明运动可以增加骨骼肌合成鸢尾素。由于其存在的多种代谢调控功效，渐渐地发展成为近年来研究的一个热点，然而由于其起始密码子为ATA(不同于常用的起始密码子ATG)，且由于相关技术的限制，其存在一直受到质疑，直到最近有科学家通过MS技术将鸢尾素的分子量鉴定出来，才使得其存在被普遍认可。其主要功能是使BAT(白色脂肪细胞)褐化，使其变成棕色脂肪细胞，而棕色脂肪细胞的功能则主要是产热。且对于二型糖尿病患者所产生的胰岛素拮抗和血糖的稳定有一定的治疗作用。近年研究发现，鸢尾素对帕金森病上也有潜在的治疗作用。随着鸢尾素的细胞受体αv整合蛋白的发现，将加快鸢尾素作用机理的揭示，并有望成为一种新的治疗药物得到开发。

鸢尾素的前体III型纤连蛋白结构域蛋白5(FNDC5)，FNDC5是一个跨膜蛋白，其中含有209个氨基酸，从N端开始1-29位的氨基酸为一个信号肽，30-123位氨基酸组成了一个FNIII结构域，其后又包含了一个无序序列(其中包含形成鸢尾素的酶切位点，但此酶尚未被揭示)和一个跨膜的疏水序列，以及一个与细胞质结合的序列。当FNDC5在酶的作用下被切断后就释放鸢尾素，进入人体循环中。在人体血液中的浓度为3-4ng/ml，在运动、寒冷等刺激下可以增加其分泌量，且有研究表明其含量与人体内的白色脂肪细胞含量呈反相关。鸢尾素分布广泛，其前体FNDC5在骨骼肌和富含肌肉的心包和直肠中表达最多，在心脏有一定的表达，在脑、肾脏、肝脏以及脂肪组织中有较少的表达。

研究发现，鸢尾素对肥胖、骨重建、糖尿病等均有一定的调控作用。但其在人体血液中的半衰期只有1小时，过短的半衰期限制了它作为药物得到开发。

发明内容

为解决鸢尾素在复性过程中出现错误二聚体以及在体内稳定性差的问题，本发明提供了一种PEG修饰鸢尾素类似物及制备方法，该类似物具有长效性。

本发明目的是由以下技术方案实现的：

一种PEG修饰鸢尾素类似物(PEG-Irisin类似物)，该类似物具有长效性，该类似物的结构式为：

所述鸢尾素类似物(Irisin类似物)是将鸢尾素59位的半胱氨酸突变成丝氨酸，其氨基酸序列见SEQ ID NO1。

进一步的，本发明目的还可以由以下技术方案实现：

一种PEG修饰鸢尾素类似物的制备方法，包括如下步骤：

1)合成鸢尾素类似物重组蛋白基因片段，将重组蛋白基因N端前段加入DDDDK和6个His序列，得到目的基因；

2)运用重组基因技术将目的基因与质粒结合，导入宿主细菌中，筛选得到正确表达宿主细菌；

3)发酵步骤2)所得宿主细菌，正确表达目的融合蛋白后，破碎细菌，得目的蛋白粗产物；

4)纯化步骤3)所得蛋白粗产物得到纯度较高的鸢尾素类似物；

5)使用PEG类似物定点修饰步骤4)所得鸢尾素类似物的N端得PEG修饰鸢尾素类似物；