[发明专利]一种简单高效的薄壳山核桃农杆菌转化体系的构建及优化

说明书

本发明公开一种简单高效的薄壳山核桃农杆菌转化体系的构建及优化。将发根农杆菌在TY固体培养基上划线培养，获得单菌落，挑取单菌落于TY液体培养基进行培养，得到活化后的发根农杆菌溶液；发根农杆菌侵染薄壳山核桃幼苗接近种子部分的胚轴或者茎部；其中薄壳山核桃幼苗接近种子部分的胚轴或者茎部位置为距幼苗根部的胚轴或茎1～5cm处；共培养、生根培养，待胚轴或茎部侵染处生长出薄壳山核桃的转基因毛状根。以幼苗作为繁殖材料进行侵染，无需无菌环境培育无菌苗进行继代操作等一系列组培技术。

技术领域

本发明属于薄壳山核桃转基因体系技术领域，涉及一种简单高效的薄壳山核桃农杆菌转化体系的构建及优化。

背景技术

目前，转基因植物转化的方法主要有农杆菌转化法、花粉管通道法、核显微注射法、基因枪法等，农杆菌介导的遗传转化体系是在植物基因工程中相对完整、成熟的方法之一。发根农杆菌是一种侵染性很强的根瘤菌科农杆菌属革兰氏阴性菌，在侵染植物后，能够诱导植物产生大量高度分支的不定根，通常称为发根。其在植物基因工程中具有广泛的应用，携带的Ri质粒能有效侵染众多植物，Ri质粒的T-DNA片段在植物细胞基因组中插入、整合并表达，诱导植物细胞形成转基因毛状根(hairy root)。基因工程中发根农杆菌侵染形成转基因毛状根是一种快速高效的转基因方法。发根农杆菌侵染植物所产生的发根具有生长速度快、分化程度高、生理生化和遗传性稳定、易于进行操作控制等特点，可应用范围广。

目前发根农杆菌介导的植物转基因基本均是利用植株的无菌苗及无菌苗的叶片或茎段作为外植体，与一定OD值的菌液共培养以获得转基因根。按照农杆菌侵染操作的不同，现有的农杆菌介导的植株转基因方法可分为菌液侵染法和注射器针头刺入法，转化率普遍较低，对于木本植物来说，茎的硬度和木质化也进一步限制了注射法的应用空间。

常规的农杆菌介导转基因主要是利用根癌农杆菌，但是这种转基因植物的构建方法仍需要大量的时间进行愈伤组织诱导和分化、继代，获得转基因植物的周期较长，操作繁琐，效率不高。

目前，薄壳山核桃转基因体系还鲜有报道，根癌农杆菌介导的转化体系周期长，效率低。因此，对于薄壳山核桃的遗传改良和基因挖掘与功能分析，需要建立一套农杆菌介导的、高效稳定的转基因体系。本发明通过发根农杆菌介导，利用薄壳山核桃幼苗，获得稳定的薄壳山核桃转基因根系，从而提供一种经济高效的转基因方法。

发明内容

本发明的目的是针对以下所要解决的技术问题，提出一种简单高效的薄壳山核桃农杆菌转化体系的构建及优化。

所述所要解决的技术问题如下：

(1)扩大农杆菌可转化的受体植物范围，检测其对薄壳山核桃的转化效果；

(2)筛选影响发根农杆菌转化效率的最关键因素；

(3)明确发根农杆菌应用于薄壳山核桃的最适转化条件，从而减少成本；

(4)提供一种基于发根农杆菌介导、稳定且高效的转基因方法。

本发明的技术方案具体如下：

本发明提供了一种发根农杆菌介导幼苗获得转基因根系的构建方法，包括以下步骤：

步骤(1)、准备薄壳山核桃幼苗；

步骤(2)、制备携带35S::GFP的发根农杆菌；

所述发根农杆菌的种类包括但不限于MSU440、C58C1或K599；如本发明实施例所示，不同的发根农杆菌种类对于毛状根的诱导率有影响，根据不同植物可选择其适宜的发根农杆菌类型。

所述的目的基因和其适宜的表达载体无特殊限定。本发明对表达载体转化发根农杆菌的方法无特殊限定，采用本领域已知的方法即可，比如热激法、电击法等等。

步骤(3)、发根农杆菌活化：