[发明专利]草甘膦抗性基因GR79和GAT的表达载体及应用

说明书

本发明涉及草甘膦抗性基因GR79和GAT的表达载体及应用。本发明提供的对草甘膦具有高耐受性的GR79基因和GAT基因的密码子优化并合成的新的DNA序列，以及利用双基因构建的植物表达载体pCGG，研究结果证明，转入了所述植物表达载体的转基因玉米不同组织中GR79和GAT基因可以正常转录和翻译，苗期叶片中GR79蛋白表达量为733.15‑2203.99ng/g，GAT蛋白表达量为101.56‑345.84ng/g，两蛋白在玉米中具有高表达量。结果表明转GR79和GAT两个基因玉米对靶标除草剂草甘膦具有高抗性，本发明对于利用这两个基因转化植物协同表达培育高抗草甘膦植物及其应用具有重要意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是涉及GR79和GAT两个草甘膦抗性基因的表达载体以及在植物耐草甘膦中的组合应用。

背景技术

我国农田的主要杂草超过250种，分布面积达4000多万公顷，其中1000多万公顷农田受害严重。我国平均每年因草害造成作物减产约13％，直接经济损失占农作物总产值的10％～20％，利用化学方法来控制杂草已成为现代农业不可缺少的一部分。

草甘膦是一种广谱灭生性、内吸传导型除草剂，凭借其广谱高效、环境友好等优点，现已成为世界上应用最广泛的农药品种。莽草酸途径是植物和微生物芳香族氨基酸合成的重要途径。在高等植物体内芳香族氨基酸中苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的生物合成过程中，5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)是关键性的酶之一。EPSPS在莽草酸代谢途径中催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)与莽草酸-3-磷酸(S3P)缩合。草甘膦是PEP的竞争类似物，其作用机理就是通过与EPSPS和S3P形成稳定的复合体EPSPS-S3P-草甘膦，竞争性地抑制EPSPS的活性，阻断了莽草酸-3-磷酸转化为5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸，使芳香族氨基酸化合物的形成受阻，同时造成莽草酸大量积累，促使类黄酮以及酚类化合物等激素和关键性代谢物失调，打乱了生物正常氮代谢进而导致生物体的的死亡。

但由于除草剂的非选择性特点使其在使用过程中不可避免的会对农作物的生长发育产生影响。20世纪80年代以来，随着生物基因工程技术的迅猛发展以及对植物抗除草剂机理分子水平上的研究进展使得通过转基因技术让农作物获得耐除草剂性状成为可能。1983年第一个除草剂抗性烟草问世，标志着这一领域的研究从探索走向成功，至今已经有多种耐除草剂转基因作物进行商业化种植，如玉米、大豆、棉花、油菜等，产生了巨大社会经济效益并在提高耕地利用效率、提高人工效率方面产生了巨大推动作用。目前商业化的耐除草剂转基因作物主要采用的有cp4-epsps、mepsps、pat等基因。

GR79和GAT基因是从草甘膦严重污染的土壤细菌宏基因组中分离并克隆。GR79基因编码EPSPS酶，草甘膦不能阻断GR79-EPSPS合酶催化PEP与S3P生成EPSP的反应，使植物芳香族氨基酸和其他化合物合成代谢继续进行，使植物获得抗除草剂能力，保护植物正常生长。GAT基因编码草甘膦-N-乙酰转移酶，草甘膦N-乙酰转移酶为作物抗草甘膦提供了不同于GR79-EPSPS途径的全新作用机制。在草甘膦-N-乙酰转移酶的作用下，乙酰辅酶A作为乙酰基供体，草甘膦分子的次级胺则作为乙酰基的受体，使草甘膦乙酰化失去除草剂活性，使转基因植物获得抗除草剂能力，保护植物正常发育生长。

GR79和GAT基因是创制耐除草剂植物的候选基因，研究者将35S启动子分别连接在GR79基因和GAT基因的前面构建了植物表达载体pGBIGRGAT转化棉花，获得转基因棉花，在T1代检测对草甘膦的耐受性，喷施草甘膦异丙胺盐溶液稀释至1/200(绝对浓度为0.205g/100ml草甘膦异丙胺盐)，喷施量为30升/亩，存活率在84％以上(CN 103981199 B)，在转基因棉花叶片中表现了低草甘膦残留量(Liang et al.Co-expression of GR79 EPSPS andGAT yields herbicide resistant cotton with low glyphosate residues.PlantBiotechnology Journal,2017,15:1622–1629)。