[发明专利]一种利用海盐渗透压胁迫筛选高产Macrolactins海洋芽孢杆菌的方法

说明书

本发明公开了一种利用海盐渗透压胁迫筛选高产Macrolactins海洋芽孢杆菌的方法，本发明以显著抑制野生海洋芽孢杆菌生长的50g/L海盐渗透压为初始筛选压力驯化目标菌株，经过多次传代培养使菌株适应该浓度海盐渗透压胁迫之后，将海盐浓度提高至60g/L开始新一轮驯化，以此类推。当海盐浓度提高至Ng/L时菌株无法生长，终止驯化过程。取(N‑10)g/L海盐胁迫的驯化菌液涂布含(N‑10)g/L海盐的ISP2固体培养基，即可获得高比例的高产Macrolactins突变菌株。本发明以适当浓度的海盐渗透压胁迫作为筛选压力结合适应性驯化策略，高效选育高产Macrolactins海洋芽孢杆菌突变菌株，解决这类菌株在选育优良菌种资源的过程中缺乏高效筛选标记的困境。

技术领域

本发明属于微生物育种技术领域，具体来说涉及一种利用海盐渗透压胁迫筛选高产Macrolactins海洋芽孢杆菌的方法。

背景技术

Macrolactins为24元大环内酯类化合物，主要来源于海生Bacillus sp.和Actinomadura sp.，包含超过32种单体化合物，表现抗病毒、抗肿瘤和抗病菌等多种生物抑制活性，是一类具有广谱生物抑制活性的化合物，在疾病治疗、农业病虫害生物防治等领域具有广阔的应用潜力。Borriss研究团队通过分析Bacillus amyloliquefaciens FZB42基因组，首次确认了PKS I型基因簇参与Macrolactins的合成。整个基因簇大小约54kb，共由11个模块组成，每个模块至少包括酰基转移酶、酮基合成酶和酰基载体蛋白三个元件。每个元件在Macrolactins碳骨架的合成过程中承担着不同的生物功能，酰基转移酶负责底物的激活和运转；酮基合成酶负责延伸聚酮链；酰基载体蛋白负责将完成延伸二个碳原子的聚酮链运转到下一模块，具体合成过程与脂肪酸碳骨架的合成过程类似。

尽管Macrolactins生物合成过程基因簇已经被成功解析，但其合成的分子调控机理和关键基因至今仍没有得到系统的解析，一定程度上限制了利用现代分子生物学技术来改善海洋芽孢杆菌的Macrolactins代谢性能。传统微生物育种技术包括理化诱变、Genomeshuffling、适应性驯化等可在遗传背景不清晰的条件下提升微生物代谢性能，但利用这类育种技术在选育优良Macrolactins代谢突变菌株时，仍需要面临不少障碍，最大问题是至今尚无高效的筛选标记应用于筛选优良Macrolactins代谢突变菌株。Yi X等人利用常压室温等离子体诱变技术(Atmospheric Room Temperature Plasma，ARTP)处理海洋芽孢杆菌，提高其Macrolactins代谢性能(Yi X,Gan Y,Jiang L,et al.Rapid improvement in themacrolactins production ofBacillus sp.combining atmospheric room temperatureplasma with the specific growth rate index[J].Journal ofBioscience andBioengineering,2020,130(1).)。具体操作过程如下：利用ARTP诱变技术处理菌株后涂布平板，根据平板上单菌落形态差异挑选出具有特异性菌落形态的菌株，进一步比较这部分菌株的生长速率差异，筛选出生长较快的突变菌株，最后通过发酵结合HPLC检测挑选出最佳突变菌株。虽然作者最终获得一株Macrolactins产量提升约50％的突变菌株，但整个筛选过程较为繁琐，可靠性不高，最终的筛选效率也仅为6.67％。简单而言，利用该策略选育优良海洋芽孢杆菌主要包括三个筛选指标：菌落形态、生长和代谢，可见利用该策略完成微生物育种工作强度较大、效率低，且由于菌落形态不再发生变化的原因育种工作最终只能实现第一轮诱变，不利于菌株代谢性能的进一步提升。

综上所述，对于遗传背景不清晰的产Macrolactins海洋芽孢杆菌而言，传统微生物育种策略是理想的手段，而无法确定有效的筛选标记一定程度上阻碍了该类菌种资源的育种进程。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用海盐渗透压胁迫筛选高产Macrolactins海洋芽孢杆菌的方法。