[发明专利]一种α-L-鼠李糖苷酶突变酶的应用

说明书

本发明公开了一种专一性转化橙皮苷生成橙皮素‑7‑O‑葡萄糖苷的α‑L‑鼠李糖苷酶、基因及其表达制备方法，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。该酶是以黑曲霉来源的α‑L‑鼠李糖苷酶r‑Rha1基因进行定点突变得到突变体S303R基因，在毕赤酵母SMD1168中表达制备而得到。该酶只水解橙皮苷，而不水解其他柑橘黄酮，可以将柑橘粗黄酮中的橙皮苷特异水解生成橙皮素‑7‑O‑葡萄糖苷，从而提高橙皮素‑7‑O‑葡萄糖苷的制备效率，为橙皮素‑7‑O‑葡萄糖苷的工业化制备提供了重要的工具酶。

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种序列改良的α-L-鼠李糖苷酶突变酶（突变体）、编码基因及表达制备方法，该α-L-鼠李糖苷酶突变酶能够专一转化橙皮苷生产橙皮素-7-O-葡萄糖苷。

背景技术

橙皮素-7-O-葡萄糖苷，分子式为C₂₂H₂₄O₁₁，是由橙皮苷脱掉1分子鼠李糖后的产物，是橙皮苷/橙皮素衍生物，非糖部分都是橙皮素。橙皮素7-O-葡萄糖苷的水溶性是橙皮苷的50倍，其生物利用度比橙皮苷好，橙皮素7-O-葡萄糖苷开环加氢后是一种新型低热值甜味剂，即橙皮素二氢查耳酮的单葡萄糖，是一种新型甜味剂的前体物质。目前，橙皮素7-O-葡萄糖苷的制备方法有化学法和生物转化法。化学法的制备条件难以控制，且目标产物容易进一步水解为橙皮素，从而使得目标产物得率较低，且易对环境造成严重污染；而酶法生物合成的条件温和，不会引起橙皮苷母核结构的变化。

柑橘黄酮粗提物中含有大量黄酮糖苷类化合物，包括橙皮苷及新橙皮苷。目前，主要是利用α-L-鼠李糖苷酶水解橙皮苷或新橙皮苷制备橙皮素7-O-葡萄糖苷。α-L-鼠李糖苷酶[E.C.3.2.1.40]可作用于黄酮糖苷类物质中α-1、α-1,2、α-1,3、α-1,4、α-1,6糖苷键连接的L-鼠李糖。当α-L-鼠李糖苷酶作用于柑橘黄酮粗提物时，不仅产生橙皮素7-O-葡萄糖苷，还会有其他副产物生成。以含橙皮苷或新橙皮苷的柑橘黄酮粗提物为原料制备橙皮素7-O-葡萄糖，需先将原料纯化成橙皮苷或新橙皮苷，再经过α-L-鼠李糖苷酶水解，再进一步纯化为橙皮素7-O-葡萄糖，需要经过2次纯化及2次浓缩结晶才能制备得到橙皮素7-O-葡萄糖，该工艺复杂，得率低。

发明内容

本发明的目的在于制备专一性转化橙皮苷的α-L-鼠李糖苷酶，可用于将柑橘粗提物中的橙皮素特异性转化为橙皮素7-O-葡萄糖苷，避免其他副产物的生成，避免二次纯化，节约成本。

为了实现上述目的，本发明解决其技术问题所采取的技术方案包括：

一种编码α-L-鼠李糖苷酶突变酶的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示。

一种α-L-鼠李糖苷酶突变酶，所述突变酶由所述基因编码，所述突变酶的氨基酸序列如SEQ ID NO .2所示。

所述基因的突变方法为，采用基因工程技术手段对从原始菌株黑曲霉JMU-TS528中克隆得到的α-L-鼠李糖苷酶r-Rha1进行定向进化，得到突变酶S303R的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示（1968 bp），其氨基酸序列如SEQ ID NO .2所示（655个氨基酸残基）。

一种表达制备所述α-L-鼠李糖苷酶突变酶的方法，表达载体为pPIC9k-S303R，寄主细胞为毕赤酵母SMD1168，甲醇诱导终浓度为0.5 %，诱导温度为30℃。

对所述α-L-鼠李糖苷酶突变酶进行表达制备，包括采用所述的α-L-鼠李糖苷酶S303R表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组α-L-鼠李糖苷酶S303R。其中，表达载体为pPIC9k-S303R，寄主细胞为毕赤酵母SMD1168，甲醇诱导浓度为0.5 %，诱导温度为30℃。