[发明专利]一种外源线粒体载体、复合物及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种外源线粒体载体、复合物及其制备方法和应用，涉及一种或几种生物相容性良好的材料修饰离体外源线粒体，并使用经修饰后的离体外源线粒体包载功能基因和/或药物，最后将两者共同递送至病变细胞治疗线粒体缺陷相关疾病。本递送系统由功能完好的离体外源线粒体、生物相容性良好的材料以及功能基因/药物组成。从自体或异体组织和细胞中提取出的线粒体mito，经过与生物相容性良好的材料特殊处理后形成coating‑mito，随后与功能基因和/或药物以一定比例混合孵育，通过非共价作用力形成外源线粒体药物复合物。外源线粒体药物复合物能高效地被受损细胞摄取，并在胞质中释放正常线粒体以及相关的功能基因和/或药物。

技术领域

本发明涉及一种移植外源性线粒体并以该线粒体为功能基因和/或药物递送载体的方法，其能达到对一系列线粒体缺陷相关疾病的安全、有效的治疗，属于生物医药技术领域。

背景技术

线粒体是存在于大多数细胞中的由两层膜包被的细胞器，是真核生物进行氧化代谢的重要场所，也是糖类、脂肪和氨基酸进行最终氧化释放能量的场所，被称为“能量工厂”。 核基因组和线粒体基因组共同维持着人体细胞的正常功能，其中mtDNA是一个约16.6kb的环状双链DNA分子，负责编码13种线粒体相关蛋白质。若涉及到编码线粒体蛋白或参与线粒体功能的蛋白质的线粒体基因或核基因突变，则会引发线粒体缺陷相关疾病。目前关于线粒体缺陷相关疾病的治疗主要集中在对症治疗（例如：使用抗惊厥药治疗MERRF引发的癫痫等）或者是使用小分子化药恢复呼吸链功能上，而不能从根本上解决线粒体的生化功能缺陷。所以使用线粒体作为载体递送功能基因和/或药物，也许是一个安全高效且能普适于几乎所有线粒体缺陷相关疾病的方法，下面以parkin功能基因为例进行介绍。

线粒体的异质性是决定线粒体相关缺陷疾病发生发展的关键因素。线粒体的异质性指同一细胞中可能包含不同比例的突变和野生型mtDNA。如果该突变是致病型的，在线粒体内突变mtDNA的比例超过生化阈值之前，细胞通常可以勉强维持正常代谢。一旦突变和野生型的比例超过阈值，线粒体的正常功能就会受到影响，出现相应的疾病症状。所以从线粒体异质性入手，降低突变型和野生型mtDNA的比值，使其不超过生化阈值，也许是解决目前线粒体缺陷相关疾病困境的一个合适方法。

一般认为，选择性地去除积累了高水平致病性mtDNA缺陷的线粒体，可以通过减少异质化来治疗相关疾病。线粒体自噬是一种通过溶酶体降解的方式将异常线粒体移除从而维持正常细胞代谢的过程，通常被认为是线粒体质量控制的主要机制。parkin是线粒体自噬中一种很重要的中间体，已有研究证明递送parkin基因可以诱导病变线粒体发生自噬且对神经退行性疾病有治疗效果。但是过度的线粒体自噬也会引起细胞的凋亡，所以不仅仅需要考虑下调病变线粒体的比例，上调正常线粒体的比例也需要被考虑。

所以本发明中使用提取出的离体外源线粒体，在其外膜上包裹生物相容性良好的材料形成coating-mito，coating-mito与功能基因通过静电吸附作用形成复合物coating-mito-gene。coating-mito-gene一方面能为细胞提供外源健康线粒体，增加了细胞内正常线粒体比例，另一方面parkin基因释放后能触发线粒体自噬通路发挥作用，下调细胞内病变线粒体的比例。通过线粒体自噬途径，被降解的线粒体能为该细胞提供营养物质，更重要的是病变线粒体与正常线粒体的比值下降直接恢复细胞活性，实现了对线粒体缺陷相关疾病的安全、有效治疗。

发明内容

目的：本发明提供一种移植外源性线粒体并以线粒体为载体递送功能基因的方法，其能达到对一系列线粒体病变相关疾病领域的安全有效彻底的治疗。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

第一方面，提供一种外源线粒体载体，为由生物相容性良好的材料包被离体外源线粒体（mito）形成，简称coating-mito；

所述生物相容性良好的材料选自壳聚糖，聚乙烯亚胺（PEI），带有吡啶基、咪唑盐、季磷盐侧基的聚合物，带正电的氨基酸多肽或脂质体成分中的一种或多种；