[发明专利]聚乙二醇化重组人促红素电荷异质性的检测方法

说明书

本发明公开了聚乙二醇化重组人促红素电荷异质性的检测方法，包括：将待检测的聚乙二醇重组人促红素样品与预混液混合，采用全柱成像等电聚焦电泳系统进行分析检测得到等电聚焦谱图；根据等电聚焦图谱分析检测样品电荷异质性。本发明检测方法利用全柱成像等电聚焦技术，在两性电解质溶液形成的连续pH梯度中利用电压对PEG‑EPO样品进行电泳，各电荷异构体电泳至与自身pI值相同的pH值位置从而实现互相分离，同时检测形成峰信号。此外，在电泳体系中加入IDA作为酸端占位剂，改善了分离度和峰形。本发明的检测方法具有良好的特异性和重复性；在50％‑150％浓度范围内、线性良好；最低定量浓度为0.11mg/ml，灵敏度高。

技术领域

本发明涉及重组人促红素荷异质性的检测方法，尤其涉及聚乙二醇化重组人促红素电荷异质性的检测方法，属于聚乙二醇化重组人促红素电荷异质性的检测领域。

背景技术

重组人促红素(EPO)是治疗肾性贫血的有效药物，随着中国肾衰透析成本降低，透析病人数量不断增加，未来EPO的需求将会逐渐增加。但是EPO半衰期短，药物频繁注射给病人带来较大的痛苦和安全风险。聚乙二醇重组人促红素(PEG-EPO)是利用聚乙二醇修饰EPO后开发的一种长效促红素，主要用于肾功能不全病人的贫血治疗。聚乙二醇修饰的蛋白质药物在血液循环中的半衰期明显延长，溶解度和稳定性得到改善，免疫原性降低，生物利用度增强，它的半衰期由重组EPO的24小时延长至130小时，明显改善了药物在临床中的局限性。

EPO和PEG-EPO均是高度糖基化的重组细胞因子，电荷异质性作为糖基化蛋白类药物的关键属性，对蛋白类药物的溶解性、稳定性、免疫原性、体内外生物活性、药物动力学发挥着关键影响，因此选择一种特异性强，灵敏度高，分离效果好的检测方法是至关重要的。目前在现有的技术中，2015版《中国药典》采用等电聚焦电泳法分析其电荷异质性。

全柱成像等电聚焦技术是通过毛细管等电聚焦(cIEF)将带有不同电荷的异质体根据其等电点的不同进行聚焦分离，在高速摄像系统支持下拍摄成像，转变为峰信号，呈现电荷异构体图谱。聚焦过程中，在外加电场的作用下，PEG-EPO样品的电荷异质体能在两性电解质形成的连续pH梯度中电泳聚焦至与其等电点相同的pH位置，在280nm下检测得到异构体分布图谱。利用在样品中加入的两种已知等电点的标记物(pI marker)标定出待测样品各异构体的等电点，并可以通过软件积分各异构体，记录各异构体峰百分比含量。

PEG化的重组人促红素虽与EPO具有相似的电荷异质性，但由于PEG链的修饰，增加了其结构复杂性，利用传统的等电聚焦电泳技术检测其电荷异质性时分离效果差，结果可分析性不足。因此需要优化检测体系，解决采用等电聚焦电泳技术检测PEG-EPO的电荷异质性时存在的分离效果差，结果可分析性不足等缺陷。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种聚乙二醇化重组人促红素电荷异质性的检测方法；

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种聚乙二醇化重组人促红素电荷异质性的检测方法，包括：(1)制备待检测的聚乙二醇重组人促红素(PEG-EPO)样品；(2)配制预混液；(3)将待检测的聚乙二醇重组人促红素样品与预混液混合，采用全柱成像等电聚焦电泳系统进行分析检测得到等电聚焦谱图；(4)根据等电聚焦图谱中等电点标记物的迁移时间和pI值，确定待分析的蛋白样品各异构体的pI值；根据等电聚焦图谱的相关信息，确定待分析的蛋白样品各异构体的含量百分比。

本发明中的术语“电荷异质性”包括但不限于聚乙二醇化重组人促红素各异构体的pI值以及各异构体含量百分比。