[发明专利]基于试卤灵染料专一响应ONOO-的荧光探针、制备方法及应用

说明书

本发明提供了一种基于试卤灵染料专一响应ONOO^‒的荧光探针、制备方法及应用，探针的结构式为：。本探针选择试卤灵染料为荧光团，二苯基次膦酰酯为识别团。检测机制是ONOO^‒同二苯基次膦酰酯基发生氧化反应，再进行一步自消除反应，释放荧光团引起荧光信号变化。上述探针通过紫外和荧光光谱仪检测ONOO^‒且不受其活性氮和活性氧类的干扰，该检测过程简便、快速、灵敏，检测限为238 nM。更重要的是该探针可以检测细胞和活体中的ONOO^‒，在生物监测领域具有良好应用前景。

技术领域

本发明涉及荧光探针领域，具体涉及一种基于试卤灵染料专一响应ONOO^‒的荧光探针、制备及应用。

背景技术

作为一种寿命短且反应活性高的活性氮物种（RNS），过氧亚硝酸盐（ONOO^‒）是由一氧化氮（NO）和超氧阴离子（O2˙^‒）通过自由扩散反应在线粒体中产生。由于其具有极强的跨膜弥散性，可通过阴离子通道穿透各种生物膜作用于酶、蛋白质以及DNA等大分子物质，参与机体的各种生理和病理过程。到目前为止，越来越多的证据表明，过量的ONOO^‒可能会引起多种疾病，例如炎症，神经退行性疾病，阿尔茨海默氏病，帕金森氏病，心血管，缺血性再灌注损伤和癌症。因此，开发一种检测细胞ONOO^‒的方法并探讨其在疾病诊断和各种病理生理特性中的作用至关重要。

迄今为止，已经探索出了多种方法用于ONOO^‒的检测，其中包括电化学分析、免疫组织化学、光致发光和化学发光等方法。在这些方法中荧光探针法具有响应速度快，灵敏度高，可视化能力强和生物创伤性低等优点，在化学分析、生物分析以及医学研究中得到了广泛的应用。近年来，这些化学反应型的荧光探针主要基于以下几种机理：硼酸酯的氧化，膦酰/次膦酸酯的氧化，酮的氧化，硒的氧化还原反应，氧化性N-脱芳基化和其他反应策略等。尽管已报道的荧光探针能够实现了对ONOO^‒的检测，但是仍然存在一些局限性，例如选择性低（某些ONOO^‒探针也可能对H₂O₂和NaClO产生响应），荧光发射波长较短（在紫外可见光区）且在生物体内成像应用匮乏等，所以构建对ONOO^‒具有高特异性的新型长波长荧光探针并实现对细胞和活体成像的研究仍迫在眉睫。试卤灵染料因其具有荧光量子产率高，发射波长长，生物相容性好等优点而被广泛关注。因此，基于试卤灵荧光染料专一性响应生物细胞内ONOO^‒的长波长荧光探针，并实现在活体层面的应用具有重要意义。

发明内容

本发明提出了一种基于试卤灵染料专一响应ONOO^‒的荧光探针、制备方法及应用，该探针制备方法操作方便，原料易得，能够实现细胞以及小鼠活体内ONOO^‒的专一性检测。

实现本发明的技术方案是：

一种基于试卤灵染料专一响应ONOO^‒的荧光探针，化学分子式为：C₃₁H₁₂NO₅P，命名为RFP，探针的结构式为：

。

所述的荧光探针的制备方法，步骤如下：

（1）N₂保护、冰水浴下，将对羟基苯甲醇溶于混合溶剂中，再加入二苯基次膦酰氯，室温反应，冰水淬灭，二氯甲烷萃取，柱层析分离得到化合物1；

（2）步骤（1）制得的化合物1溶于二氯甲烷中，加入四溴化碳和三苯基膦，室温搅拌，然后减压去除溶剂，柱层析分离得到化合物2；

（3）先将试卤灵和碳酸钾溶于N,N-二甲基甲酰胺中，再加入步骤（2）所得化合物2，室温反应，冰水淬灭，二氯甲烷萃取，柱层析分离得到荧光探针。