[发明专利]大肠杆菌工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明涉及一种大肠杆菌工程菌及其构建方法和应用，在传统中药巫山淫羊藿的转录组中挖掘到了四个关键酶编码基因，通过基因克隆技术将其从巫山淫羊藿的cDNA中克隆出来，用不同表达载体将4个基因构建形成重组质粒，验证活性，最终构建两个共表达载体转化至大肠杆菌中形成工程菌，实现松属素的高产。本发明通过基因工程技术，实现了从传统中药植物中发掘一系列基因，并利用组合生物合成以及代谢工程手段成功获得了一种高产松属素的工程菌。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种高产松属素的工程菌及其制备方法和应用。

背景技术

酮类化合物广泛分布于自然界中，与人类生存活动息息相关。黄酮类化合物基本骨架为C6-C3-C6，即由两个苯环通过中间3碳链连接而成，苯环上具有多个可取代(修饰)位点，决定黄酮类化合物具有广泛的药理活性。例如，柚皮素、芦丁、黄芩苷、银杏双黄酮、儿茶酚等具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗肿瘤的功效。

松属素是黄酮类化合物生物合成途径是一种重要的中间体，又是合成良姜素、高良姜素、白杨素等多种黄酮化合物的前体物，本身也具有抗菌、抗原虫、抗诱变等药理活性。

目前，松属素的生产方法主要为植物提取和化学合成，且以植物提取为主。然而，采用从植物中分离提取松属素的工艺方法会遭遇多种不确定因素，如生长环境对植物次生代谢产物的影响、耗费大量人力物力、不符合可持续发展理念，且需要用到有机试剂等，会对环境造成一定程度的污染。而采用化学合成获取松属素的方法产率较低，无法做到大规模、高效率的合成，同时对环境污染严重，两种方法均非长久之计。

发明内容

基于此，有必要提供一种大肠杆菌工程菌及其制备方法和应用，利用微生物代谢实现高效生产松属素，生长环境可人为控制，繁殖速度快，产物后续处理较为简单，便于实现规模化，避免有机试剂对环境造成的污染。

本发明的技术方案如下：

本发明提供一种大肠杆菌工程菌，能够同时表达合成松属素所需的苯丙氨酸解氨酶EwPAL、香豆酸辅酶A连接酶Ew4CL、查尔酮合成酶EwCHS和查尔酮异构酶EwCHI。

优选地，苯丙氨酸解氨酶EwPAL的同源性达90％及以上，香豆酸辅酶A连接酶Ew4CL的同源性达80％及以上，查尔酮合成酶EwCHS的同源性达85％及以上，查尔酮异构酶EwCHI的同源性达50％及以上。

该大肠杆菌工程菌在生产松属素中进行应用。

本发明还提供一种大肠杆菌工程菌的构建方法，包括如下步骤：利用载体pACYCDuet，构建含编码基因EwPAL和编码基因Ew4CL的重组载体pACYC Duet-EwPAL-Ew4CL；利用载体pRSF Duet，构建含编码基因EwCHS和编码基因EwCHI的重组载体pRSF Duet-EwCHS-EwCHI；将pACYC Duet-EwPAL-Ew4CL和pRSF Duet-EwCHS-EwCHI同时转化至大肠杆菌中，即得。

优选地，获取各编码基因的方法为：以巫山淫羊藿为实验材料，提取其总RNA，反转录获得cDNA，通过PCR反应扩增获得EwPAL、Ew4CL、EwCHS和EwCHI的全长基因序列。

具体地，构建重组载体pACYC Duet-EwPAL-Ew4CL的方法步骤为：在pACYC Duet多克隆位点选取EcoRI和HindIII两个酶切位点进行酶切，纯化回收线性载体，通过In-Fusion克隆技术，添加基因EwPAL，得pACYC Duet-EwPAL；再在pACYC Duet-EwPAL的多克隆位点选取NdeI和XhoI两个酶切位点进行酶切，纯化回收后载体骨架，继续添加基因Ew4CL，得pACYCDuet-EwPAL-Ew4CL。

优选地，构建重组载体pACYC Duet-EwPAL-Ew4CL所采用的引物包括：pACYC Duet-EwPAL-Ew4CL-For：