[发明专利]一种D-泛解酸内酯水解酶及其产生菌、基因工程菌及它们的应用

说明书

本方案公开了生物工程技术领域一种D‑泛解酸内酯水解酶产生菌，所涉及的微生物为一种梭孢壳菌Thielavia sp.zmu20201，菌种保藏编号为CCTCC：M2020062。同时，本发明还公开了一种来源Thielavia sp.zmu20201菌株的D‑泛解酸内酯水解酶及其工程菌株，该D‑泛解酸内酯水解酶的氨基酸序列编号如SEQ ID NO.2所示。此外，本发明还公开了以Thielavia sp.zmu20201发酵菌体或内酯水解酶基因工程菌株发酵菌体作为生物催化剂，拆分D,L‑泛解酸内酯制备光学纯D‑泛解酸的应用。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种D-泛解酸内酯水解酶及其产生菌、基因工程菌及它们的应用。

背景技术

D-泛解酸是制造D-泛酸钙、D-泛醇、D-泛硫乙胺的关键手性中间体。D-泛酸钙广泛应用于饲料、医药和食品工业，尤其是作为重要的饲料添加剂，已成为需求量仅次于烟酸的维生素。随着食品和饲料工业的发展，目前全球D-泛酸钙产品市场供不应求。

D-泛解酸制备的主要技术难题是D,L-泛解酸内酯的手性拆分。目前D,L-泛解酸内酯手性拆分的方法有化学拆分、物理拆分法和生物酶法拆分。化学拆分技术需使用昂贵的奎尼酸、番木鳖减等拆分试剂，分离工艺复杂，污染问题严重；物理拆分技术的条件苛刻，光学纯度低，收率不高。因而，D-泛解酸化学拆分和物力拆分生产工艺的成本较高，产品质量往往难以保证。生物酶法拆分技术使用高立体选择性的内酯水解酶，反应条件温和，催化剂廉价，环境污染小，分离纯化工艺简便，产品光学纯度高，生产成本低。目前，全球D-泛解酸的生产主要采用生物酶法拆分技术。

虽然生物酶法拆分D,L-泛解酸内酯制备D-泛解酸具有优势，但是目前报道的可以用于工业化生产应用的产内酯水解酶微生物较少。目前产泛解酸内酯水解酶的菌株主要来源于廉孢霉菌(Fusarium)，赤霉菌(Gibberella)，粘帚霉(Gliocladium)和黑曲属(Aspergillus) 等真菌。目前已产业化应用的产内酯水解酶微生物仅有日本Fuji公司使用的尖孢镰孢菌 Fusarium oxysporum IF05942(US Patent 5,275,949,1994；US Patent 5,372,940,1994)和浙江鑫富生化股份有限公司使用的串珠镰孢霉Fusarium moniliformeSW-90(CN1313402A)。

发明内容

本发明提供了一种D-泛解酸内酯水解酶产生菌，其来源于梭孢壳菌属(Thielavia)的微生物Thielavia sp.zmu20201，菌种保藏编号为CCTCC NO：M2020062，该微生物发酵获得的生物酶可以高效立体选择性水解D-泛解酸内酯。同时，本发明提供了一种来源Thielavia sp. zmu20201的工程菌株，该工程菌株可以高效表达D-泛解酸内酯水解酶，并可用于拆分D,L- 泛解酸内酯制备光学纯D-泛解酸。

具体而言，本方案通过产内酯水解酶微生物的筛选获得了具有高活性和高立体选择性的 D-泛解酸内酯水解酶产生菌。

进一步，我们通过基因工程技术，从Thielavia sp.zmu20201菌株中克隆编码对应D-泛解酸内酯水解酶的基因，其基因序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

进一步，本发明提供的D-泛解酸内酯水解酶还在大肠杆菌和酵母菌中实现了高效表达，构建D-泛解酸内酯水解酶基因工程菌。

进一步，通过Thielavia sp.zmu20201菌株和D-泛解酸内酯水解酶基因工程菌的发酵获得含有D-泛解酸内酯水解酶的微生物细胞，以全细胞作为生物催化剂，催化外消旋D,L-泛解酸内酯制备光学纯D-泛解酸。

本发明的详细过程如下：