[发明专利]一种固相时间分辨荧光免疫标记物及其制备方法和应用

说明书

本发明提供一种固相时间分辨荧光免疫标记物及其制备方法和应用，所述固相时间分辨荧光免疫标记物包括蛋白质标记的β‑二酮体类螯合剂、稀土金属离子和生物特异性结合反应物。该固相时间分辨荧光免疫标记物无需加入增强液或生物素‑亲和素体系进行信号放大，即可直接参与免疫反应并可直接用于检测，操作简单，用时短，具有可重复性，克服了现有技术中时间分辨分析法需添加增强液导致污染、操作繁琐、反应时间长、且标记物生产一致性差的问题。且该标记物可于4℃下保存，或通过冻干工艺，制成粉状，于常温干燥条件下稳定保存。

技术领域

本发明属于体外诊断技术领域，具体涉及一种固相时间分辨荧光免疫标记物及其制备方法和应用，尤其涉及一种灵敏度高、准确度高、生产一致性好、操作简便、风险小的固相时间分辨荧光免疫标记物及其制备方法和应用。

背景技术

时间分辨荧光免疫分析(Time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)技术是一种新型的以镧系稀土元素络合物作为标记物，测量其发射荧光强度的体外超微量分析技术。由于时间分辨荧光免疫分析法相对于其他放射免疫分析法来说，具有更高的灵敏度和准确度，近年来该技术在临床检测、生命科学、医学等研究领域中的应用越来越广泛，已成为一种极具发展前景的分析手段。

TRFIA利用具有独特荧光特性的三价稀土元素离子及其络合物作为示踪物，得益于稀土络合物荧光寿命长、激发光谱带宽、发射光谱窄及Stokes位移大等荧光特性。稀土元素作为金属离子，不能直接与抗原抗体结合，因此在标记过程中需使用具有双功能基团的络合配体，实现与稀土元素离子形成配位，同时在不影响荧光强度的前提下与生物分子共价结合。TRFIA技术在30多年的演化和发展过程中，国内外学者对荧光稀土络合配体进行了大量研究，如多氨基多羧基类络合物、芳香羧酸类络合物及β-二酮体类络合物等。

CN105911041A公开了一种时间分辨荧光检测方法，把特异反应体系的一株生物原料包被在磁珠上，将包被生物原料的磁珠与被测样本反应，清洗后加入另一株已标记β-二酮类稀土配合物的特异性生物原料，发生免疫反应，使磁珠、被测样本和荧光示踪物形成复合物，清洗后再加入荧光增强物，最后用时间分辨荧光仪检测，获得被测样本的浓度等信息。

CN106053783A公开了一种适用于结核感染T细胞检测的快速时间分辨荧光免疫分析试剂盒，本发明的试剂盒采用了γ-干扰素体外释放法，联合采用了生物素亲和素法，双抗体夹心时间分辨荧光免疫法，实验方法简单快速，可自动化操作，检测系统为开放式操作系统。

目前TRFIA可分为均相分析法和固相分析法，前者需要使稀土金属离子从络合物中解离下来，与增强液中的增效剂形成新的可产生荧光的络合物，用于仪器测量。但是由于增强液中存在过量的β-NTA，使其极其容易被环境中的稀土金属离子污染，造成背景信号的升高，操作及保存都需非常小心。后者应用FIAgen系统，利用4,7-二氯磺基苯-1,10-二氮杂菲-2,9-二羧酸螯合剂(BCPDA)螯合稀土金属离子经紫外光激发，发出荧光信号。该体系在生物素-亲和素体系信号放大的基础上，有效弥补了BCPDA检测灵敏度的不足(10-11mol/L)。但该体系需进行两步或多步反应，反应过程长，且试剂组成复杂。后者还可直接使用生物特异性结合反应物与β-二酮体类螯合剂结合的标记物，但该种标记物一致性较差，灵敏度差，仅可在-20℃保存，使用过程繁琐。

因此，开发一种操作简便，灵敏度高且风险小的固相标记物是非常有意义的。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种固相时间分辨荧光免疫标记物及其制备方法和应用，尤其提供一种灵敏度高、准确度高、生产一致性好、操作简便、风险小的固相时间分辨荧光免疫标记物及其制备方法和应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种固相时间分辨荧光免疫标记物，所述固相时间分辨荧光免疫标记物包括蛋白质标记的β-二酮体类螯合剂、稀土金属离子和生物特异性结合反应物。