[发明专利]I-motif重组介导的FRET探针及其原位成像癌细胞表面蛋白质同源二聚化的应用

权利要求书

1.一种用于原位成像癌细胞膜上蛋白质的同源二聚化的i-motif重组介导的FRET探针，其特征在于：包括执行链 Half-i @ Apt和预阻滞链 Blocker；所述执行链 Half-i @Apt 包含 Half-i序列、Linker序列、目标蛋白的适体序列、与 Linker 以及Half-i 的部分序列互补的 Linker*，并将 Cy5和 Cy3分别标记在 Half-i 和 Linker*的 5'末端用作FRET的受体和供体；整个 Linker、部分 Half-i 以及部分的蛋白适体序列被 Blocker链预先封锁； 所述 Half-i为由 i-motif的形成序列分裂获得的完全对称的两部分；所述执行链 Half-i @ Apt 的序列 SEQIDNo.1 为

Cy5-TCCCCCCTCCCCCCATTGATGATCTATTTTTTTTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTTTTTTTT-Cy3-TAGATCATCAATGTGG。

2.如权利要求 1 所述的用于原位成像癌细胞膜上蛋白质的同源二聚化的 i-motif重组介导的 FRET 探针，其特征在于，所述预阻滞链 Blocker的序列 SEQIDNo.2 为

AACCCACCCACCCCGACCGAGCTACCATCCAAAAAAAATAGATTATCAATG

GGG。

3.如权利要求 1 所述的用于原位成像癌细胞膜上蛋白质的同源二聚化的 i-motif重组介导的 FRET 探针，其特征在于，制备方法如下：

将Half-i@Apt链和 Blocker链的浓储液混合，加热至 90~95℃维持 4~5 分钟后缓慢冷却至室温，然后在 3~5℃环境下避光放置 8 小时以上，使两条链充分杂交，即得。

4.如权利要求 3所述的用于原位成像癌细胞膜上蛋白质的同源二聚化的 i-motif重组介导的 FRET 探针，其特征在于，Half-i@Apt链和 Blocker 链的浓储液的混合比例为 1∶1~1.5。

5.如权利要求 3 所述的用于原位成像癌细胞膜上蛋白质的同源二聚化的 i-motif重组介导的 FRET探针，其特征在于，所述浓储液的溶剂为 TE 缓冲液。

6.权利要求 1或2所述的探针在癌细胞表面蛋白质同源二聚化原位成像中的应用。

7.如权利要求 6 所述的应用，其特征在于，包括：用不同浓度的 HGF 处理 HepG2 细胞，以诱导 Met 受体发生不同水平的同源二聚化；细胞与 HGF 孵育 25~35分钟后，除去培养基并清洗细胞，然后加入探针，避光孵育 10~17 分钟；然后，将细胞用 PBS 洗涤 2-3次以进行 CLSM 成像。

8.如权利要求 7 所述的应用，其特征在于，所述避光孵育时间为 15~16 分钟。

9.如权利要求 7 所述的应用，其特征在于，共聚焦扫描成像参数如下：用525nm激光以10％的强度激发，使用 HyD检测器以 200％的 gain 值为在 550 nm至 600 nm 范围内收集Cy3 的发射荧光，使用 PMT 检测器以 700的gain 值在 650 nm 到 700 nm波长范围内收集 Cy5 的荧光。