[发明专利]一种沙棘根瘤内生菌培养基及其制备、分离培养方法

说明书

本发明一种沙棘根瘤内生菌培养基及其制备、分离培养方法，涉及生物技术领域；培养基原料包括沙棘根茎叶果发酵物，是通过对沙棘叶、沙棘根、沙棘茎和沙棘果进行发酵得到的；制备方法是将沙棘根茎叶进行酶解，再将沙棘果加入水解酪蛋白、KH₂PO₄和MgSO₄制成营养液，将酶解液和营养液通过米曲霉发酵制得；接种时对沙棘根瘤菌挤压涂布的方法进行；通过本发明培养基可以促进沙棘Frankia内生菌的生长，同时对其它土壤根际微生物产生抑制作用，通过根茎叶果的成分进行了酶解和发酵，使Frankia内生菌对营养成分更容易吸收、利用和转化，有效的促进了Frankia内生菌在培养基内的生长代谢。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种沙棘根瘤内生菌培养基及其制备、分离培养方法。

背景技术

Frankia菌是与非豆科植物共生形成根瘤，属于能固定大气氮的放线菌。由于该菌是根瘤内生菌，对其分离比较困难。Callaham等1978年首次从Comptonia peregrina的根瘤中分离出内生菌以来，Frankia菌的分离工作才有了较大的进展。1985年杜大至从中国沙棘的根瘤中首次分离出Frankia sp. HR104。杜大至所选用的培养基为MS培养基修改的CSM-1号培养基和克氏合成一号培养基，在27℃，培养20天。前人对Frankia菌的分离培养所选用的培养基有察氏培养基、葡萄糖天门冬素培养基、苹果酸钙培养基、马铃薯浸汁培养基、克氏合成一号培养基、燕麦粉培养基、甘油苹果酸钙培养基、CMS-1号培养基、QMOD培养基等。Frankia菌的特点是分离困难，并且在人工培养基内生长缓慢，2—12周才能达到稳定期。针对Frankia菌分离和培养难的特点，我们对SM培养基进行了改进，形成了沙棘Frankia菌分离专用的培养基，在该培养基中第一加入了沙棘根茎叶果的成分。李倩2015年发现，土壤中黄酮的主要是由植物的根分泌的。韦小英2016年报道，黄酮可以改变土壤根际微生物的数量比，使细菌与真菌数量的比值和放线菌与真菌数量的比值略有降低。且黄酮处理植株的根际微生物，可使线菌数量明显提高。沙棘内生菌与沙棘根形成的根瘤是一种共生关系，也是长期共进化的结果，因此沙棘黄酮可以促进沙棘根瘤内生菌的生长，而对其它土壤微生物有抑制作用。

发明内容

本发明克服了现有技术的不足，提出一种沙棘根瘤内生菌培养基及其制备、分离培养方法，解决沙棘根部的Frankia内生菌不易分离培养的问题。

为了达到上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的。

一种沙棘根瘤内生菌培养基，原料包括沙棘根茎叶果发酵物；所述沙棘根茎叶果发酵物是通过对沙棘叶、沙棘根、沙棘茎和沙棘果进行发酵得到。

优选的，所述沙棘根茎叶果发酵物包括以下重量份的原料：沙棘叶8-12份、沙棘根3-6份、沙棘茎3-6份、沙棘果3-6份。

更优的，所述的沙棘叶、沙棘根、沙棘茎和沙棘果为干制品。

优选的，具体包括以下步骤：所述沙棘根茎叶果发酵物的原料还包括微量元素储备液和Na₂-EDTA储备液，所述微量元素储备液包括H₃BO₃、ZaMoO₄^.2H₂O以及钙、铜、锌、锰离子。

优选的，所述沙棘根茎叶果发酵物是通过米曲霉发酵得到。

一种沙棘根瘤内生菌培养基的制备方法，包括以下步骤：

a）沙棘根茎叶酶解液的制备：将沙棘叶、沙棘根、沙棘茎粉碎，加入纤维素酶和果胶酶45-55℃酶解3-5天，酶解过程中每天搅拌一次，制得沙棘根茎叶酶解液。